根皮苷氧化物POP2的酶促反应体系及其结构表征

【目的】根皮苷氧化物POP2是苹果汁加工过程中由酶促氧化生成的一种多酚氧化物,对果汁的褐变和劣变有着重要影响。通过多酚氧化酶氧化根皮苷反应体系的建立,POP2的分离纯化与结构表征,探讨根皮苷氧化物POP2合成条件与反应历程,为苹果汁中POP2的检测分析,及弄清其对果汁褐变和劣变的影响奠定基础。【方法】通过pH、温度、底物浓度3个单因素试验建立根皮苷酶促氧化体系的基础上,研究乙醇溶液对酶促反应的促进作用和反应历程,通过高效液相色谱法检测根皮苷酶促氧化过程中根皮苷、中间产物及POP2含量的变化,通过乙酸乙酯萃取、无水乙醇除盐、重结晶等方法对氧化产物POP2进行分离纯化,并采用质谱（ESI-MS）和红外光谱（IR）对POP2进行结构表征。【结果】根皮苷酶促氧化反应的最佳条件为pH 6.5、35℃、底物浓度3 mg?mL^-1,添加不同浓度的无水乙醇均能显著提高根皮苷酶促氧化速率,当添加浓度为20%时,可提高反应转化率,最大为2.4倍;根皮苷反应液随时间的变化颜色也发生改变,反应刚开始溶液颜色呈微黄色,随着反应的进行颜色逐渐从亮黄色变为橙黄色,最终产物的颜色为橙红色;高效液相色谱法分析根皮苷酶促氧化反应历程发现,当底物浓度为3 mg?mL^-1,反应48 h时,根皮苷的转化率最大为90.2%,中间产物X1和POP1也基本接近痕量,POP2的积累量基本不再发生变化;通过乙酸乙酯萃取可以将反应液中残留的根皮苷除去,用无水乙醇除盐并经甲醇重结晶后,获得纯度为96.8%的POP2;经正离子模式ESI-MS分析,POP2的m/z为467,分子式为C₂₁H₂₂O₁₂;IR结果发现POP2具有特征性的醚、氧化羧基、酮基及苯环官能团,与推测的根皮苷氧化物结构式吻合。【结论】根皮苷酶促氧化体系中的主要氧化物为POP2,可以根据POP2的含量高低建立苹果汁褐变和劣变的标志性检测指标。     

固定化漆酶酶促合成茶黄素工艺的研究

[目的]探索固定化漆酶酶促合成茶黄素的工艺。[方法]采用D152树脂固定化漆酶体外酶促氧化茶多酚合成茶黄素。通过单因素试验研究反应温度、pH、酶浓度、反应时间和通氧量对合成茶黄素的影响,在此基础上进行茶黄素的酶促氧化合成反应,之后测定茶黄素产量。[结果]采用树脂载体D152固定化得到的固定化漆酶,在重复使用5次后,固定化漆酶催化活性约为原始催化活性的70%;在重复使用10次后,酶催化活性仍然可以保留48%左右。固定化漆酶促氧化的最佳条件为：反应温度60℃,最佳pH 5,底物浓度2.0g/L,通氧量20 L/min和反应时间1.5 h。[结论]采用树脂载体D152可有效固定漆酶。与游离漆酶氧化法相比,固定化法能有效提高漆酶的稳定性和利用效率,反应产物也更易于纯化。     

漆酶对苹果酚类物质的催化特性

【目的】研究白腐菌漆酶对苹果多酚类物质的催化特征,为开发新型具有生物活性的色素物质提供理论依据。【方法】采用单因素和正交组合试验确定白腐菌漆酶对苹果多酚酶促氧化的最佳条件,并对氧化产物的稳定性进行分析;然后对酚类氧化产物进行HPLC分析,初步确定产物组分,最后分析了苹果多酚及其氧化产物对.OH和DPPH.的清除作用。【结果】①漆酶对苹果多酚的最佳酶促氧化条件为:反应温度55℃,pH 5.5,苹果多酚质量浓度2.5 mg/mL,漆酶浓度3.5 U/mL。②氧化产物在363 nm处有最大吸收峰,对温度和光照不敏感,随着pH增大颜色加深。③HPLC分析表明,模式底物儿茶酚、表儿茶素、儿茶素分别能产生2,2,4种氧化产物。④抗氧化活性研究表明,质量浓度较高时,苹果多酚氧化产物对.OH和DPPH.的清除作用强于苹果多酚,且在一定质量浓度范围内呈现量效关系。在氧化产物质量浓度为500μg/mL时,对.OH的清除率最高,达85.42%;在氧化产物1 000μg/mL、反应时间为60 min时,对DPPH.的清除率最高,达94.32%。【结论】优化了漆酶催化苹果多酚氧化的工艺条件,苹果酚类物质经漆酶催化氧化后形成了新的可溶性、光热稳定性的有色产物,高质量浓度下产物的抗氧化活性较原提取物增强。     

漆酶诱导北美沙地葡萄抗毒素Res合成及代谢研究

为明确真菌漆酶(laccase)对北美沙地葡萄Vitis rupestris抗毒素白藜芦醇(Resveratrol)合成及代谢的影响,采用高效液相色谱(HPLC)法,对白腐菌云芝漆酶与白藜芦醇的体外催化反应条件及产物进行研究;并通过病原菌harpin蛋白预诱导抗病沙地葡萄细胞悬浮系后,采用漆酶处理或非处理,检测白藜芦醇合成及代谢情况。试验结果显示,漆酶在醋酸缓冲液pH 4.5、25℃、150r·min-1、黑暗条件下,与白藜芦醇催化反应2h,可将白藜芦醇氧化形成二聚体葡萄素(δ-viniferin)。漆酶作为一种真菌致病因子能诱导Vitis rupestris细胞合成反式白藜芦醇(trans-resveratrol),并迅速将其氧化为抗性更强的δ-viniferin。同时,漆酶能与病原菌致病蛋白harpin协同诱导葡萄白藜芦醇合成及代谢,以提高沙地葡萄抗性。     

木薯叶多酚氧化酶的提取及其酶学性质研究

以木薯叶为原料,研究木薯叶多酚氧化酶PPO的最佳提取条件与酶学性质。结果表明,木薯叶PPO 的 最佳提取条件为磷酸缓冲液PBS的pH 值6.8料液比4 mL/g提取时间6 h;木薯叶PPO 酶促反应产物在399 nm 处有最大吸收峰,以邻苯二酚为底物的酶促反应的米氏常数Km=0.8 mol/L动力学方程为V=2000[S]/0.8+[S]该酶最 适温度为37益,最适pH 值为7.0。     

Km与Ks的区别和联系

在酶促反应动力学中,Km是酶的重要特征常数之一,它只与酶的性质有关,而与酶的浓度无关。它的物理意义是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。但在过去的文献以至教科书中,一直将Km与另一个和酶促反应有关的常数Ks混用。Ks是酶(enzyme,E)和底物(substrate,S)所形成中间产物ES的解离平衡常数。1956年     

油包水(W/O)型微乳液中m-6菌木质素降解酶的研究

【目的】研究W/O十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)微乳液体系和HAc-NaAc缓冲液体系中,m-6菌株固态发酵后产生的胞外木质素降解酶漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)酶促反应的最佳反应条件。【方法】通过分别对Lip(以2,2′-连氮-二(3-乙苯基并噻唑-磺酸)为底物)、Mnp(以MnSO4为底物)和Lac(以藜芦醇为底物)3种木质素降解酶在W/O型CTAB微乳液体系和HAc-NaAc缓冲液体系中的酶活测定,研究不同温度、pH和底物浓度对酶促反应的影响,探讨最佳反应条件,并比较两种反应体系下的酶活。【结果】在W/O型CTAB微乳液体系中,Lip、Mnp和Lac 3种酶酶促反应的最佳条件为:温度37℃、pH分别为4.5,4.5和3.5;在HAc-NaAc缓冲液体系中,3种酶酶促反应的最佳反应条件为:温度37℃,pH分别为5.0,5.0和4.0;在两种反应体系中的最佳反应底物浓度相同,即藜芦醇、MnSO4、2,2′-连氮-二(3-乙苯基并噻唑-磺酸)浓度分别为0.053,0.116,0.492 mmol/L。在W/O型CTAB微乳液中,Lip和Mnp酶活比其在HAc-NaAc缓冲液体系中分别提高了81.45%和36.75%,但Lac酶活却减少了2.914倍。【结论】得到了Lac、Lip和Mnp酶3种木质素降解酶在W/O型CTAB微乳液体系和HAc-NaAc缓冲液体系中的最佳反应条件,为木质纤维素的生物降解奠定了基础。     

利用内源性底物和外源性底物比较分析荔枝的多酚氧化酶活性

荔枝褐变的主要原因是多酚氧化酶的酶促褐变,以及多酚氧化酶引起的其它次生代谢物而使其发黑变质。另外,在果实衰老过程中,因膜脂过氧化破坏膜结构,为酚类物质的酶促褐变创造了条件,加速了酶促褐变。JianSun等通过硫酸铵盐析分离纯化荔枝多酚氧化酶（PPO）,利用内源性底物表儿茶素和外源性底物儿茶酚比较分析了荔枝的多酚氧化酶活性,其结果表明,内源性底物和外源性底物对荔枝多酚氧化酶活性的激活效应不同,底物中添加乙二胺四乙酸钠时,对多酚氧化酶活性的抑制效果均表现为最弱.     

胰蛋白酶酶解鹿血条件的优化

研究了胰蛋白酶对鹿血的酶解作用,以酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除能力为指标,分析了酶浓度(酶∶蛋白)、底物浓度(鹿血∶水)、pH值、酶解时间和酶解温度等因素对酶解反应的影响.结果表明,最佳酶解条件是酶浓度为8%,底物浓度(鹿血∶水)为1∶3,pH值为7.5,酶解时间为3 h,酶解温度为55℃.在此条件下酶解产物对超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率分别可达91.63%和94.32%.     

麦麸中植物酯酶的提取及其在有机磷农药残留检测中的初探

本文初步确定了麦麸中提取植物酯酶的工艺、酶促反应的最佳检测波长和酶促反应最适条件。酶活测定采用分光光度法,波长确定为533纳米,酶活力用单位时间酶促反应速率表示。酶促反应的最佳条件为:酶液保存温度0～5℃;反应温度40℃,保温时间15分钟,pH7.5,酶量30μL,8毫克/毫升固兰B盐0.5毫升,3毫克/毫升底物(α-乙酸蔡酯)200μL。同时探讨了从麦麸中提取的植物酯酶用于快速检测蔬菜中农药残留的方法。