PpDREB2基因植物表达载体的构建

以p3301-BI121质粒为基础,通过中间载体pGEX-KG,构建了由CaMV35S启动子调控的PpDREB2基因植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2,选择标记为PPT(Phosphinothricin),通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105, 为通过根癌农杆菌介导法将PpDREB2基因导入植物奠定基础。     

芥菜植株原位真空渗入遗传转化方法的研究

以蕾期的芥菜生态型雪里蕻和圆叶芥为试材,在携带潮霉素磷酸转移酶标记基因的根癌农杆菌菌株GV3101的介导下,对影响芥菜植株原位真空渗入遗传转化效果的真空渗入时间、根癌农杆菌悬浮孢子的浓度、渗入培养基、感染方式以及根癌农杆菌菌株等进行研究。结果表明,真空渗入时间为2min／间歇30s／30s;菌液浓度OD600为0．8;渗入培养基为1／2MS无机 B5有机;菌株采用强感染型的;对花蕾进行真空渗入,可以获得最佳转化效果。     

拟南芥启动子rd29A在长春花中的瞬时转化及功能鉴定

拟南芥诱导型启动子rd29A作为低温及盐胁迫的诱导型启动子,其在长春花中的生物学功能为长春花转基因植物的构建提供了一个可控的基因表达体系。本研究通过克隆拟南芥启动子rd29A,替换双元载体p BI121中组成型启动子Ca MV 35S构建表达载体rd29A::GUS,经根瘤农杆菌(GV3101)介导转化长春花顶端分生组织实现GUS基因在rd29A启动子驱动下的瞬时表达。表明:同常温条件(25℃)相比,经低温诱导(4℃)12 h后长春花中GUS基因表达量升高了四倍,GUS染色也同时证明了低温可成功诱导rd29A启动子在长春花中的生物学活性,进而为长春花诱导型基因表达的转基因植物构建提供了可行的理论依据。     

Mini-Ti质粒在农杆菌菌株间的转移

用农杆菌介导法将外源基因导入植物是植物遗传转化的一种首选方法。为了获得较高的转化率,往往需要选择对转化目标植物敏感的农杆菌菌株。本实验利用冻融法将农杆菌LBA4404/pCG-Ⅱ中的目的片段转移到农杆菌EHA105中,通过PCR扩增、斑点杂交和测序,证明了农杆菌LBA4404/pCG-Ⅱ中的目的片段已成功转移到农杆菌EHA105中。利用该方法更换农杆菌菌株,可满足不同植物对不同农杆菌菌株的要求。     

农杆菌侵染小麦的优化方案

本实验选用优质高产小麦品种洛阳8716和绵阳19幼胚愈伤作为受体材料,以pCAMBIA3301为载体,GV3101,EHA105,LBA4404农杆菌为供体材料进行侵染过程的优化研究.采用3种菌株,4个浓度梯度:OD600=0.2,0.5,0.7,1.0;3个时间参数:10 min,30 min,60 min;一共36个处理,每个处理4个重复.结果显示,农杆菌GV3101和EHA105,OD600 1.0×10 min和OD600 0.5×30 min两个侵染处理结果比较好,瞬时表达率达到50%-70%.以小麦幼胚愈伤组织为受体,预培养3～5 d,在24±1℃下,共培养3～4 d和350 mg/L羧苄青霉素除菌及5 mg/L PPT筛选处理后,转化效果较好,平均转化率为0.45%.     

大豆GmMYB12B2植物表达载体的构建及转化烟草

为研究大豆MYB转录因子-GmMYB12B2在转基因植物类黄酮代谢中的作用,利用吉林大学植物种质资源与利用研究室前期克隆的GmMYB12B2基因,以PPZP质粒为表达载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动GmMYB12B2基因的植物表达载体PPZP-GmMYB12B2;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行遗传转化。经PCR随机扩增鉴定9株转基因烟草,其中有6株是阳性植株,初步证明已获得转大豆GmMYB12B2基因的烟草。     

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94,17．69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301, 并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）,经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

甘菊DlBADH1基因启动子DBP12表达特性研究

用pCAMBIA1305.2做载体,构建含有甘菊(Dendranthema lavandulifolium)DlBADH1基因(登录号:DQ011151)启动子DBP12(登录号:DQ497621)的质粒pCHW-2.利用叶盘转化法,通过农杆菌EHA105菌株介导,将重组质粒导入烟草叶片.采用GUS组织活性检测法鉴定烟草转基因植株,结果表明:DPB12启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性.对转基因植株进行NaCl、ABA、SA处理,GUS荧光测定发现:100μmol/L ABA胁迫处理24 h和400 mmol/LNaCl胁迫处理48 h,转pCHW-2烟草植株叶片中GUS酶活性均有大幅度提高.该结果表明:DlBADH1基因启动子DBP12是一个诱导型启动子.这一研究结果为进一步研究甘菊中BADH基因调控表达机理提供了参考.     

小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化

以小麦的幼穗和幼胚作为转化受体,首次用抗除草剂草甘麟的EPSPs基因作为选择标记,通过基因枪法共转化,将小麦编码高分子量谷蛋白亚基的基因1Dx5和1Dy10转移到普通小麦京花1号中,获得33株再生植株,经PCR初步检测有12株同时扩增到了3个处在不同质粒上的外源基因EPSPs, 1Dx5和1Dy10的目标片段。将部分PCR检测为阳性的转化体     

Cre/loxP定位重组系统在植物雄不育和杂种优势中的利用研究

Cre—loxP是来源于噬菌体P1的一种位点特异性重组系统。目前，它已广泛应用于基因功能鉴定，动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在杂种优势的利用中具有重要意义。本实验是以Cre—loxP系统调控细胞毒素基因barnase在植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达，从而达到控制植物育性的目的。1．在本实验中，通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的barnase基因，及其抑制因子barstar的DNA序列，同时，构建成功双元表达载体及基因枪转化载体，并已获得经分子险测呈阳性的小麦植株。2．osg6B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子，它在小孢子发育的四分体时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达，它具有较为严紧的时空特异性。以osg6B为启动子，构建了一组受控于Cre／loxP位点特异性重组系统的适用于基因枪法转化小麦的载体系统。其中，转不育基因(og6B—barnase)小麦植株生长正常，但开花后，花粉量明显减少，自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现，转基因小麦大部分花粉表现为败育。花粉离体萌发试验表明，转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低，几近败育。说明以osg6B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。3．以osg6B为启动子，构建了一组受控于Cre／loxP的用于控制双子叶植物育性的双元表达载体系统。以转cre基因的烟草作为受体，以含阻断序列的质粒农杆菌进行二次转化。二次转化株营养生长正常，但开花期花器官表现异常。具体表现为花瓣异常开裂或不开裂，花丝变短或粘连，花药提早萎蔫或异常开裂。推测这种现象的出现与启动子的组织特异性或barnase的渗露表达有关。4．二次转化株花粉染色因不同株系出现全部败育、部分不育和多数可育的情况。花粉离体萌发实验也得到了相似的结果。这说明通过筛选，利用Cre／loxP得到完全不育的植物株系是完全可行的。5．获得了9个barnase的突变体，初步推测第十四位氨基酸及第八十位氨基酸与核糖核酸酶活性有关。同时，发现barnase的第316位核苷酸序列为易突变位点，自然发生的突变多插入一个C，从而产生终止位点的改变。这或许会为今后barnase的克隆与利用提供一些参考。     

农杆菌介导NHX基因转化甘蓝型油菜的研究

以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体，通过根癌农杆菌EHA105（Agrobacterium tumefaciens）介导将盐地碱蓬（Suaeda heteroptera）的Na⁺/H⁺反向运输体基因NHX导入新疆主栽油菜1khp11品系中，获得了抗卡那霉素的再生植株，并对影响遗传转化的一些关键因素进行了研究。结果表明,带柄子叶在含有2,4-D的培养基上经过3 d预培养后于浓度OD₆₀₀为0.3～0.4的菌液中浸染7 min, 卡那抗性绿苗率可达8%～9%，经过对抗性植株的PCR检测、点杂交及PCR-Southern杂交证明外源基因已整合到油菜基因组中，为新疆盐碱土上油菜产量的提高提供了新的途径。     

无毒基因在稻瘟病菌株007中的克隆鉴定及表达分析

为了能明确稻瘟病国际标准菌株race 007中包含的无毒基因及其可能的主效无毒基因,本研究设计5个常见的无毒基因特异性引物进行克隆鉴定,并分别检测液体培养条件下和侵染水稻过程中race 007菌株中5个无毒基因的表达情况。本研究发现,稻瘟病菌株race 007中含有PWL2、AvrPiz-t、Avr-pik、Avr-pita、ACE1 5个无毒基因,克隆鉴定的结果表明这5个无毒基因的变异不大。相比较于液体培养条件下,在侵染水稻的过程中,PWL2表达上调,ACE1、AvrPiz-t、Avr-Pik表达基本不变,而Avr-Pita基因表达出现了下调。因此PWL2基因表达变化较为显著,本研究进一步对PWL2启动子区域进行分析,结果表明该PWL2基因启动子区域存在着一些顺式作用元件来影响PWL2基因的表达。本研究表明,稻瘟病菌race 007含有5种常见的无毒基因且序列变异不大,而且PWL2基因的表达是受到调控并可能发挥主要的致病作用。     

PRRSV强、弱毒株Nsp9基因对PRRSV复制的影响

为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强、弱毒株的Nsp9基因对PRRSV复制的影响,构建含有PRRSV XH-GD强毒株、CH-1R弱毒株Nsp9全长基因的质粒p IRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD、p IRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R,并将重组质粒分别转染到Marc-145细胞中,以MOI=1的剂量接种PRRSV XH-GD毒株,通过TCID50试验测定病毒的滴度,采用荧光定量PCR和Western Blot方法来测定病毒的N蛋白表达情况。结果表明,转染弱毒株CH-1R Nsp9基因的Marc-145细胞中,PRRSV的N蛋白在mRNA水平、蛋白质水平上的表达量均高于转染强毒株XH-GD组,且病毒的滴度也显著高于转染强毒株XH-GD组。综上,在Marc-145细胞中,弱毒株CH-1R Nsp9基因对PRRSV复制的促进作用优于强毒株XH-GD。     

根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生

以甘薯优良品种"新大紫”的茎尖培养再生植株为试材,经根癌农杆菌介导将甘薯块根贮藏蛋白启动子(Sporaminpromoter)调控下的10kD玉米醇溶蛋白基因导入到"新大紫”中,并获得了转化植株.甘薯品种"新大紫”再生植株的茎切段,与携带有表达载体质粒pSP10Z的根癌农杆菌菌株LBA4404共培养后,在含75mg/L卡那霉素(Kan)的筛选培养基上可     

对虾急性肝胰腺坏死病病原毒素基因在不同环境下表达差异研究

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是由副溶血弧菌引起的对虾病害,给世界养虾业造成了严重的经济损失。本文旨在研究主要致病因子Pir毒素基因在不同环境因素处理下的表达差异,初步探究抑制Pir毒素基因表达的可能措施。应用荧光定量RT-PCR技术,采用比较CT值法检测致病菌中Pir毒素基因在不同温度和pH条件下的表达量。结果表明,试验分离株为引发对虾AHPND毒素蛋白Pir的致病株,在18℃、24℃、30℃和36℃条件下,Pir毒素基因的表达量随温度的增加而升高,在pH 7、pH 8和pH 9条件下,Pir毒素基因的表达量随pH的上升而降低,且pH因素对其表达量差别较大。研究结果为探究副溶血弧菌致病力强弱和环境因素的关系提供了基础数据,同时也为养殖生产中AHPND防控策略的制定提供了科学依据。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

野蘑菇菌丝生长培养基的优化筛选

试验用菌株是分离自山西省右玉县的野生种,经过多次分离纯化,发现该菌株在PDA培养基上的长势缓慢且菌丝稀疏,极易老化等。结合现有关文献资料,对其菌丝培养基进行了优化筛选,旨在对其生长及液体培养生长机理的进一步研究奠定基础。以菌丝长速和菌丝干质量为测量指标,结合菌丝长势情况,筛选出了适合该菌株生长的基础培养基、碳源、氮源、碳氮比和无机盐,并进一步正交试验优化,得到了该菌株的最佳培养基。     

表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯的获得

用农杆菌介导法将bar基因导入甘薯主栽品种徐薯18的胚性悬浮细胞中,获得了抗除草剂的转基因植株.农杆菌菌株EHA105携带的双元载体pCAMBIA3300上含有bar基因.来自于徐薯18胚性悬浮细胞的直径为0.7～1.3 min的280个胚性细胞团用于遗传转化.共培养3 d后,首先在含有2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb的液体MS培养基中培养1周,然后将胚性细胞团转移到添加2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb 和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上进行选择培养.选择8周后,将获得的37个PPT抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100mg/L carb和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上,其中的34个愈伤组织诱导得到体细胞胚并发芽形成小植株,共获得了164株拟转基因植株.PCR分析表明,其中的123株为转基因植株.Southern blot和Northern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中并正确表达.除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性.