多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及原核表达

为鉴定多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基（TmPKA-C）基因作为诊断抗原的潜能,本试验以多头带绦虫成虫RNA为模板,利用RT-PCR扩增TmPKA-C基因。将TmPKA-C基因片段连接至pET-30a原核表达载体进行原核表达,然后利用Western blotting和间接ELISA分析该蛋白的反应原性。结果表明,TmPKA-C基因开放阅读框的长度为1 032 bp,可编码343个氨基酸。TmPKA-C基因的表达产物主要以包涵体的形式存在,重组蛋白的分子质量大小约42 ku。Western blotting结果表明,该重组蛋白既能与自然感染脑多头蚴的绵羊血清发生特异性反应,又能与人工感染脑多头蚴不同时间段的绵羊血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA分析结果表明,脑多头蚴绵羊血清能与重组蛋白发生特异性反应,进一步证明该重组蛋白的反应原性良好。本研究为筛选脑多头蚴病诊断新抗原奠定了基础。     

多头带绦虫的分类研究进展

对于寄生在中枢神经系统外的多头蚴,有人将其命名为格氏多头蚴,并且认为是区别于脑多头蚴的一个新的株或基因型;也有人将其命名为斯氏多头蚴或认为是脑多头蚴的同种异名。现就目前报道的寄生在绵羊中枢神经系统及山羊中枢神经系统外的多头带绦虫的分类现状进行简要综述,主要依据流行病学从传统形态学及现代分子生物学两方面进行阐述,为多头带绦虫的分类工作提供科学依据。     

多头带绦虫TPx基因的生物信息学简析

从患病绵羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α后测序,克隆到的TmTPx基因开放阅读框为591bp,编码196个氨基酸。运用DNASTAR、Rpsblast等软件对TmTPx基因进行生物信息学分析,能确定TmTPx的蛋白表面暴露区、蛋白骨架柔韧性、蛋白抗原指数、功能域等,利于从分子水平了解TmTPx的功能及多头带绦虫的生理代谢、进化分类。     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT—PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA，并亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上，转化至大肠埃希氏菌BL21，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明，从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA，序列长度为481bp，包括471bp的开放阅读框，与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致；SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒产生了约42ku的目的带，其中EG95蛋白质的分子质量约为15．2ku，与预期结果一致；Western-blotting试验检测表明，融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示，EG95基因高度保守，所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

烟碱酰胺合成酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。     

猪Viperin主要抗原区的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增猪Viperin蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体p ET32a,转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白得到表达,分子质量约为40 ku。进一步优化蛋白表达条件为:IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导5 h。采用His标签单抗对重组蛋白进行Western blot鉴定表明蛋白具有良好的抗原性。将蛋白质纯化后免疫新西兰大白兔,间隔14 d免疫4次,并采集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,结果表明,经过4次免疫血清抗体效价达到1∶409600,间接免疫荧光检测出现特异荧光,表明其能与Viperin蛋白发生反应。本试验为研究Viperin的功能、建立特异的检测方法奠定了基础。     

鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

将编码鸡白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白相对分子质量约为23000。包涵体被6mol／L盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白及其纯化产物经3次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡IL-18融合蛋白，并制备了抗鸡IL-18多克隆抗血清，为下一阶段关于鸡IL-18重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。     

多头带绦虫甘肃分离株线粒体NADH脱氢酶亚基Ⅰ基因片段差异分析

应用线粒体DNA中的NADH脱氢酶亚基Ⅰ(ND1)基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,构建系统进化树,分析其种内变异.结果表明,所有多头带绦虫(T.multiceps)分离株均成功扩增出约0.5kb的ND1基因片段.序列分析显示,去除引物序列后多头带绦虫的ND1基因片段长为488bp,可以分为9类,共有22个核苷酸变异位点,变异率为0.20%～2.66%.基于ND1序列的系统进化树表明所有T.multiceps分离株构成1个分支,可分为3个亚群,国内分离株分别处在不同的亚群中.国内分离株中除了与已知的遗传变异型Tm1(AY669089/Tm-JT081204/Tm-JT090331)和Tm3(DQ077820/Tm-JT080526)相同外,还存 在新的遗传变异型(Tm-JT081008/Tm-JT090603/Tm-JT090115-2),独立为一支,与其他分离株亲缘关系较远;表明ND1基因片段适合作为研究T.multiceps分离株种内变异的分子标记.     

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因保守结构域所在片段的克隆及原核表达

为了克隆和表达编码扩展莫尼茨绦虫无精症缺失(DAZ)基因,试验根据GenBank中扩展莫尼茨绦虫DAZ基因cDNA序列(登录号为GH291478)设计1对特异性引物,以扩展莫尼茨绦虫组织总RNA为模板,RT-PCR扩增DAZ基因,并克隆到pMD19-T载体中进行序列测定,构建重组质粒pET28a-DAZ,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析表达产物,通过螯合琼脂糖凝胶FF亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明:重组DAZ基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白分子量约为14 ku。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

多头带绦虫Tm7基因的表达及间接ELISA检测方法的建立

以多头带绦虫Tm7重组蛋白为抗原,建立动物多头蚴病早期诊断方法.本研究从羊脑多头蚴原头节提取总RNA,采用RT-PCR技术首次扩增出Tm7基因的全序列,该基因的开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸.将此基因克隆到pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a-Tm7,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.以纯化后的表达蛋白作为抗原,建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白间接ELISA方法.研究结果表明,Tm7基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物为约27 ku的融合表达蛋白,该蛋白能识别羊脑多头蚴病阳性血清.建立的间接ELISA方法,检测敏感性可达93.3％,特异性达94.1％,研究结果表明Tm7重组蛋白可作为脑多头蚴病的诊断抗原.     

Cloning and Prokaryotic Expression of Protein Kinase A Catalytic Subunit Gene from Taenia multiceps

To study the potential of protein kinase A catalytic subunit of Taenia multiceps (TmPKA-C) gene as a diagnostic antigen, the TmPKA-C gene was amplified by RT-PCR from the total RNA of Taenia multiceps. The TmPKA-C gene fragment was ligated into prokaryotic expression vector pET-30a and transformed into Escherichia coli Transetta (DE3) strain, then the reactonogenicity of recombinant TmPKA-C protein was analyzed by Western blotting and indirect ELISA. The open reading frame of TmPKA-C gene was 1 032 bp, encoding 343 amino acids. The expression product of TmPKA-C gene mainly existed in the form of inclusion body, and the molecular weight of recombinant protein was about 42 ku. Western blotting analysis showed that the recombinant protein could react specifically with the sera from naturally infected sheep with coenurosis, and it could also have specific reaction with the sera of artificial infected sheep with coenurosis. The indirect ELISA analysis showed that the sera from the coenurosis of sheep could react specifically with the recombinant protein. These results proved that the recombinant protein had good reactionogenicity. This study laid a foundation for the search of new diagnostic antigens for coenurosis of sheep.     

猪带绦虫六钩蚴TSOL16基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR技术,从猪带绦虫六钩蚴中成功地克隆了TSOL16基因。序列分析表明,猪带绦虫六钩蚴TSOL16基因的开放阅读框（ORF）为402 bp,编码134个氨基酸,与报道的T.ovisTO16基因同源性为95.9%,推导的氨基酸序列同源性为92.6%。同时利用生物信息学和分子生物学软件对TSOL16基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明该蛋白为一结构松散的球状蛋白。     

广西沼泽型水牛IL-18和TNF-α基因的克隆与序列分析

从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单核细胞(PBMCs),用刀豆素A(ConA)诱导培养3,8和12 h后,提取细胞总RNA,以Oligo(dT)18为引物合成第一链cDNA,根据牛的白细胞介素18(IL-18)和绵羊的肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因序列设计2对特异性引物,通过PCR方法扩增出水牛IL-18和TNF-α基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序后进行序列分析。结果试验中所克隆到的IL-18和TNF-α基因序列的开放阅读框(ORF)分别为602 bp和715 bp,与GenBank所登录的水牛IL-18和TNF-α核苷酸序列同源性为99.1%和99.7%,其推导的氨基酸序列同源性分别是99.0%和98.7%。表明成功从水牛外周血中克隆到了水牛IL-18和TNF-α基因。     

Modification of accessory activity of sheep monocytes in vitro by a coenurus antigen from Taenia multiceps.

A factor in Taenia multiceps coenurus fluid (TMCF) has previously been shown to modify the accessory activity of murine macrophages in vivo and in vitro. The factor (TMCF-F24) has been purified by ion exchange in a fast protein liquid chromatography (FPLC) system. This study was conducted to determine whether TMCF-F24 is an antigen in naturally occurring cerebral coenuriasis, and whether it can also modify normal sheep blood monocytes. Specific IgG antibodies to TMCF-F24 were detected, using ELISA, in serum and cerebrospinal fluid of sheep with clinical coenuriasis. Alterations in monocyte accessory activity were detected by an assay which measured the rate of increase in mitogen-induced lymphocyte transformation caused by addition of increasing numbers of the monocytes. Normal monocytes caused a positive increase in lymphocyte transformation. Monocytes incubated with TMCF-F24 caused progressive inhibition of transformation. This factor may therefore modify monocyte-T cell interaction in natural infection.     

猪带绦虫六钩蚴TSOL18真核表达载体pVTSOL18m的构建

根据Kozak原理设计引物，以重组原核表达载体pGEX—TSOL18为模板扩增TSOL18基因，用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后与经相同处理的pVAX1载体连接并转化JM109感受态细胞，经测序证明读码框正确后，再根据PCR点突变的方法设计引物。将目的基因NruⅠ位点中的碱基（第347位）经三次PCR反应突变，最终获得含突变位点的TSOL18m基因。EcoRI、XhoI再次酶切后与pVAX1载体连接，成功构建了含点突变的重组pVAX1表达载体，为TSOL18基因重组犬2型腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

牛源环孢子虫18 S rDNA部分序列的扩增与克隆分析

将采自广东省的牛源环孢子虫样品经套式PCR扩增,获得了18SrDNA基因中大小为296bp的目的片段,对该序列进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系。结果显示,该虫序列与已报道的广州牛源环孢子虫虫株完全一致,与其他艾美耳球虫的亲缘关系较近,在广东首次发现的牛源环孢子虫属于艾美耳科环孢子虫属的一新种。表明18SrDNA基因在环孢子虫进化和分类鉴定研究上是一种有效的分子标记。     

猪带绦虫腺苷酸激酶的克隆及其重组蛋白免疫反应性的评价

为原核表达猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK),对其免疫性进行初步研究,本研究以猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中ADK同源基因重组质粒为模板,通过PCR扩增并将其亚克隆于原核表达载体pET28a(+),构建了pET-Ts-ADK重组质粒,经IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE鉴定,表明重组蛋白约30ku。经His-镍蛋白纯化柱纯化后western blot试验表明该重组蛋白可被猪带绦虫、亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明猪带绦虫ADK基因在原核表达系统中表达获得的蛋白具有免疫反应性。     

犬脾细胞白介素-18(IL-18)基因的克隆与序列分析

为了研究白细胞介素-18(IL-18)的活性和功能，将犬脾细胞经ConA诱导，用TRIzol裂解，提取总RNA，通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出犬IL-18的cDNA，然后连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，获得阳性重组质粒。核苷酸序列结果表明，我们得到了长686bp的基因，含有一个582bp的开放阅读框架，编码193个氨基酸。与已知犬序列同源性可高达99．6％，与已知猪序列的同源性为89．8％，所克隆基因为今后进一步研究IL-18基因的功能奠定了基础。