家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）表面蛋白提取法研究

对微孢子虫表面蛋白的提取法研究表明,在微孢子虫的纯化中采用蔗糖法,甘油法及Ｐｅｒｃｏｌｌ法,结果Ｐｅｒｃｏｌｌ法是纯化微孢子虫的理想方法,微孢子虫表面蛋白采用高盐法,碱法及ＳＤＳ法提取,其蛋白量的ＯＤ值分别为０．０９４,０．０２１和０．２６８,ＳＤＳ法提取量最多。     

不同种类微孢子虫DNA制备方法的研究

对不同种类微孢子虫DNA的制备方法进行了比较,TEK法对不同种类微孢子虫DNA的损伤小,获得量较高,适合于不同各类微孢子虫DNA的制备。     

广西昆虫微孢子虫资源调查及其特性分析

[目的]全面掌握广西昆虫微孢子虫资源及其分布情况,并进行感染性和分类研究,为经济昆虫微孢子虫病的防控提供参考依据.[方法]通过人工捕捉或诱虫灯引诱方式在广西蚕区的桑园、菜地及周围收集野外昆虫,显微镜检验各种野外昆虫微孢子虫的自然感染率;通过生物试验鉴定部分野外昆虫微孢子虫对家蚕的食下感染性,并分别检测桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染性;基于SSU rRNA序列构建昆虫微孢子虫系统发育进化树,明确昆虫微孢子虫的分类特征.[结果]广西昆虫微孢子虫资源分布广泛,大部分昆虫已感染微孢子虫,其中菜粉蝶、稻纵卷叶螟、桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾和红腹灯蛾的微孢子虫自然感染率分别为54.95%、4.38%、0.08%、0.28%、0.64%和1.14%,其他鳞翅目昆虫的总体微孢子虫感染率为0.75%.部分昆虫微孢子虫可食下感染家蚕,交叉感染率达40.00%;部分昆虫微孢子虫还具有很强的胚种传染力,其中桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染率分别为77.48%和66.15%.从桑尺蠖分离获得的3株微孢子虫虽然为不同的微孢子虫,但均属于Nosema属,与家蚕微孢子虫同属异种.[结论]在广西各地区存在丰富的昆虫微孢子虫资源,种类多样,且大部分昆虫微孢子虫属于Nosema属,与家蚕微孢子虫亲缘关系密切;部分野外昆虫微孢子虫还对家蚕形成交叉传染危害的风险,因此杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施.     

二氧化氯（ClO2）在桑叶消毒上的应用研究

为探讨二氧化氯（ClO2）对桑叶质量、家蚕微孢子虫和肠球菌的灭活作用及其稳定性、腐蚀性,以直接喷洒桑园桑叶和浸泡离体桑叶消毒的方式,测定ClO2对桑叶质量的影响,并用悬液法和桑叶片载体法处理家蚕微孢子虫,测定ClO2对微孢子虫的灭活效果。结果显示,浓度在500 mg/L以下的ClO2溶液对桑叶质量无显著影响;采用悬液法时,30 mg/L ClO2溶液处理6.0 min即可达到完全杀灭家蚕微孢子虫的效果,而漂白粉精浓度需要达到0.24%才具有同等效果;采用桑叶片载体法时,300 mg/L ClO2溶液处理10.0 min可达到完全杀灭家蚕微孢子虫的效果。以10 mg/L ClO2溶液处理1.0 min,可完全杀灭家蚕肠球菌。ClO2稳定性较差,对金属具有中度腐蚀性。可见,ClO2适合作为桑叶消毒剂用于预防家蚕微粒子病的发生。     

10株微孢子虫Hsp70基因克隆及系统发育分析

对10株不同来源的微孢子虫Hsp70基因部分序列进行扩增,并进行了系统发育分析,结果表明:所设计的引物可以有效地扩增出10株家蚕等昆虫微孢子虫Hsp70基因中1136 bp大小的片段。遗传距离矩阵和系统发育分析表明,家蚕微孢子虫与野外昆虫微孢子虫的亲缘关系密切,再次从分子水平上证明了家蚕病原微孢子虫来自环境中的野外昆虫微孢子虫的可能性;不同微孢子虫在不同寄主中的寄生生活是一个相互选择和适应的过程;微孢子虫Hsp70基因具有遗传多样性;家蚕微孢子虫是一个种复合体。     

家蚕微孢子虫转宿主果蝇的研究初探

[目的]研究家蚕微孢子虫对果蝇的侵染性,为系统研究家蚕微孢子虫侵染机制提供新视野,也为探索微孢子虫的生物防治效果提供参考。[方法]用家蚕微孢子添食野生型和突变型果蝇,并用Calcofluor White M2R荧光染色法进行果蝇体液内的家蚕微孢子虫形态观察。[结果]结果表明,家蚕微孢子虫在转宿主情况下能够侵染果蝇,且被感染的突变型果蝇体内家蚕微孢子虫的数量多于野生型果蝇。[结论]家蚕微孢子虫能侵染果蝇,该研究结果为研究家蚕微孢子虫侵染其他宿主提供了初步参考,为进一步了解和认识家蚕微孢子虫侵染机制奠定了基础。     

菜粉蝶微孢子虫对家蚕胚种传染性与蚕桑质量的影响

据报道,菜粉蝶微孢子虫能感染家蚕并对家蚕生理代谢产生一定的影响。近年来,笔者对家蚕各级原种、1代杂交种进行母蛾镜检发现椭圆形偏细的微孢子虫,而且检出率极高,其形态大小与家蚕微孢子虫存在一定差异,即长轴与家蚕微孢子虫长轴相当,而短轴偏短。经显微镜观察测量发现,该微孢子虫形态呈椭圆形,大小平均(3.52±0.38)μm×(1.52±0.13)μm,与野外菜粉蝶寄生的微孢子虫形态相似,大小、体积、长短轴比相当。同一地理位置野外分离得到的微孢子虫与家蚕寄生微孢子虫亲缘关系较近,对家蚕的胚种传染性如何?为了进一步弄清楚菜粉蝶微孢子虫对家蚕的危害情况,对正常家蚕添食当地桑园收集纯化的菜粉蝶微孢子虫,分析微孢子虫对当代蚕和子代蚕的胚种传染性,并综合评价菜粉蝶微孢子虫对蚕桑质量的影响。结果表明,感染微孢子虫的家蚕生长发育正常并能完成其生活世代,对体质、茧质、卵量的影响不明显,但对种茧育母蛾检验毒率的判定影响很大。     

二氧化氯(ClO_2)在桑叶消毒上的应用研究

为探讨二氧化氯(ClO2)对桑叶质量、家蚕微孢子虫和肠球菌的灭活作用及其稳定性、腐蚀性,以直接喷洒桑园桑叶和浸泡离体桑叶消毒的方式,测定ClO2对桑叶质量的影响,并用悬液法和桑叶片载体法处理家蚕微孢子虫,测定ClO2对微孢子虫的灭活效果。结果显示,浓度在500 mg/L以下的ClO2溶液对桑叶质量无显著影响;采用悬液法时,30 mg/L ClO2溶液处理6.0 min即可达到完全杀灭家蚕微孢子虫的效果,而漂白粉精浓度需要达到0.24%才具有同等效果;采用桑叶片载体法时,300 mg/L ClO2溶液处理10.0 min可达到完全杀灭家蚕微孢子虫的效果。以10 mg/L ClO2溶液处理1.0 min,可完全杀灭家蚕肠球菌。ClO2稳定性较差,对金属具有中度腐蚀性。可见,ClO2适合作为桑叶消毒剂用于预防家蚕微粒子病的发生。     

我国四省区熊蜂中微孢子虫的自然感染率

采用SSUrRNA基因序列检测鉴定方法,初步调查了甘肃、青海、四川、内蒙古26种1008只熊蜂的微孢子虫感染情况及种类.结果表明:其中有16种210只被微孢子虫感染,感染率为20.8%,白背熊蜂和西伯熊蜂的微孢子虫感染率最高,红束熊蜂的感染率最低.内蒙古地区熊蜂微孢子虫的感染率最高,四川次之,甘肃与青海地区熊蜂的微孢子虫感染率最低.感染熊蜂的微孢子虫有熊蜂微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫和发现于鳞翅目卷叶蛾科寄主上的Nosema thomsoni.这说明微孢子虫对我国熊蜂的感染很广泛.     

家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性分析

为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性,采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析,并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征,以验证其保守性;进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料,利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现,Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守,Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带,而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带,说明Nbslp2相对保守,并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标;RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性,进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用,为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。     

家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析

[目的]从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征.[结果]不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率(毒率)呈波动起伏态势.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫(GXM6和GXM13)对家蚕无胚种传染力.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异.[结论]广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性.     

云南菜粉蝶微孢子虫感染家蚕的病原性研究

微孢子虫是一种营专性寄生生活的单细胞真核生物,它可以传染多种昆虫,致使昆虫死亡。在野外昆虫体内已发现许多种微孢子虫,以鳞翅目昆虫中所占比例较大;其中有多种微孢子虫对家蚕有感染性、致病性,且有部分微孢子虫能通过胚种传染而使下一代致病。本研究对云南蒙自地区桑园四周收集到的菜粉蝶进行镜检,将检测出的微孢子虫感染家蚕,并对菜粉蝶微孢子虫病原性进行了分析研究。结果表明,菜粉蝶微孢子虫对家蚕有很强的食下感染能力,虽然对家蚕的胚种传染率很低,由于它的存在,提高了家蚕母蛾微孢子虫病的检出率,增加了蚕种淘汰的风险率,对蚕种生产具有潜在的危害性,这种微孢子虫引起的垂直传播应当引起重视。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)对三峡库区菜青虫(Pieris rapae)的感染性研究

本试验用不同浓度的家蚕微孢子虫感染三峡库区菜青虫,结果表明:家蚕微孢子虫对菜青虫感染性较强,致死率高,其致死中量(ID50)为:1.5×104个/m l。当微孢子虫浓度为1.0×107个/m l时,菜青虫死亡率高达87.8%,校正死亡率也高达86.4%,体现了家蚕微孢子虫对菜青虫的显著致病能力,由此探索了家蚕微孢子虫作为生物农药的可行性。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)感染菜粉蝶(Pieris rapae)幼虫初探

采用不同浓度的家蚕微孢子虫感染三峡库区菜粉蝶幼虫—菜青虫,结果表明:家蚕微孢子虫对菜青虫感染性强,致死率较高,其半致死浓度(LC50)为:1.46×104/mL。当微孢子虫浓度为1.0×107/mL时,菜青虫死亡率高达88.9%,校正死亡率也高达87.2%,显著体现了家蚕微孢子虫对菜青虫幼虫的致病能力,由此探索了家蚕微孢子虫做为生物农药的可行性。     

柞蚕微孢子虫孢子人工发芽的研究

采用6种人工发芽方法研究了柞蚕孢子虫孢子发芽条件。试验发现，柞蚕微孢子虫孢子的发芽率存在较大差异，其中KHCO3 K2CO3法发芽率最高，达78.86%。在柞蚕微孢子虫孢子的人工发芽过程中，K^ 和Na^ 对其有促进作用，并且K^ 对柞蚕微孢子虫孢子发芽的促进作用明显强于Na^ 。Ca^2 和Mg^2 则对孢子发芽有显阻碍作用，CO3^2-有协同促进作用。而且，还证实柞蚕微孢子虫孢子在人工发芽过程中的完全发芽时间为10min。经固定染色后发现孢子发芽前后的形态发生变化，并能观察到弹出的极丝。     

蚕种生产大环境中微孢子虫污染情况调查分析

调查分析了2005～2008年广西桂中蚕种场、柳城县蚕种场蚕种生产大环境中微孢子虫的污染情况。结果表明,蚕种生产环境被微孢子虫污染的情况在逐年加重,桑园、桑叶是微孢子病原的重要污染源;同一年内生产环境中微孢子虫的检出情况,总体上呈现出上半年微孢子虫检出率稍高于下半年的现象;野外昆虫微孢子虫检出率呈上升趋势,其严重程度与蚕种发生微粒子病关系密切;环境消毒可以有效杀灭大环境中的微孢子虫,大幅度降低环境中微孢子虫的分布机率。因此,应定期或不定期使用有效药物加强对蚕种生产环境的彻底消毒,可降低环境中微孢子虫的分布机率;而采取桑叶消毒可降低家蚕食下传染微粒子病的机会,达到有效控制蚕种生产微粒子病发生的效果。     

不同品种及性别家蚕感染菜粉蝶微孢子虫差异性分析

为了解不同品种及不同性别家蚕感染菜粉蝶微孢子虫的差异性,利用菜粉蝶微孢子虫对9个不同的家蚕品种(8个原种、1个杂交种)进行感染性添食试验,添食菜粉蝶微孢子的浓度和数量均相同。结果表明,家蚕各品种之间感染菜粉蝶微孢子虫的情况存在明显的差异,秋华最容易被微孢子虫感染,皓月感染力最低。同时,对不同家蚕品种雌雄蛾感染率进行调查,发现家蚕雌雄蛾之间感染菜粉蝶微孢子虫的差异并不显著。     

东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-11248及其靶基因SGT1的生物信息学和表达谱研究

【目的】对前期鉴定所获得的东方蜜蜂微孢子虫的nce-miR-11248进行表达和序列验证,预测、分析其靶基因,并检测nce-miR-11248及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱,为进一步开展nce-miR-11248调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制研究提供参考。【方法】利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-11248的真实性;利用相关生物信息学软件预测nce-miR-11248的靶基因,并分析其编码蛋白的分子特性;使用MEME和TBtools软件预测SGT1蛋白的保守基序和结构域,通过Mega 11.0软件进行氨基酸序列多重比对,采用邻接法构建系统进化树。采集东方蜜蜂微孢子虫孢子侵染1,2,4,6和8 d的意蜂工蜂中肠组织,采用RT-qPCR检测nce-miR-11248及其靶基因SGT1的表达谱。【结果】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在,其序列长度为25 bp。nce-miR-11248的靶基因为SGT1。SGT1蛋白分子式为C₇₆₅H₁₂₁₃N₁₉₅O₂₄₁S₄,分子质量约为17.10 ku,脂溶系数为82.67,等电点为5.50,亲水系数为-0.709,不含典型的信号肽和跨膜结构域,可同时定位于细胞核、线粒体和过氧化物酶体。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、泛胞虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1中均含有4个保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4)和1个结构域(SGT1超家族结构域)。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1进化距离最近。相较于侵染东方蜜蜂微孢子虫后1 d,侵染后2,4,6和8 d nce-miR-11248的表达量均显著下调(P＜0.05);侵染后2,4,6和8 d SGT1的表达量均下调,其中侵染后4,6和8 d的表达量与2 d的差异达显著水平(P＜0.05)。【结论】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在;东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1亲缘关系最近;随着侵染时间的延长,nce-miR-11248及其靶基因SGT1在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达量均呈持续下降;nce-miR-11248和SGT1是潜在的参与调控微孢子虫侵染过程的因子。     

东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的 生物信息学分析

旨在解析东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）基因STPK的理化性质和分子特性，并对东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的STPK进行结构域和保守基序预测及系统进化分析，以期丰富东方蜜蜂微孢子虫的STPK信息，并为深入开展STPK的功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析STPK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种STPK的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的STPK进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建基于STPK的系统进化树。结果显示：东方蜜蜂微孢子虫STPK基因含2 595个核苷酸，编码的STPK蛋白含864氨基酸。分子量约为101.08 kDa，分子式为C₄₅₂₈H₇₁₅₀N₁₁₆₂O₁₃₇₉S₃₆，脂溶系数为88.48，等电点为5.47；STPK包含40个丝氨酸磷酸化位点，24个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫及柑橘凤蝶（Papilio xuthus）的STPK均含有2个相同的结构域（PK_Tyr_Ser_Thr和Pkinase）与5个相同的保守基序（Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4和Motif 5）。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫的STPK序列一致性介于38.14%~61.06%，东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微粒子虫的STPK序列一致性最高（61.06%）。东方蜜蜂微孢子虫STPK（AAJ76_500008712）与颗粒病微粒子虫（Nosema granulosis）STPK（KAF9763807.1）聚为一支，微孢子虫属（KAH9412228.1）、脑炎微孢子虫（KAG5858968.1）和兔脑炎微孢子虫（ECU01_1320）的STPK聚为一支，康氏泰罗汉孢虫（KAF7683612.1）和蝗虫微孢子虫（AAT12343.1）聚为一支。研究结果明确了STPK的理化性质和分子特性，揭示东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9种微孢子虫的STPK具有较高的保守性。     

家蚕不同龄期感染菜粉蝶微孢子虫的差异性分析

为分析菜粉蝶微孢子虫对家蚕不同龄期的感染力差异,利用在云南省蒙自市收集的菜粉蝶,对其体内的微孢子虫进行分离、纯化与鉴定。通过叶面添食的方法,先后将菜粉蝶微孢子虫(约1.21×108粒)分别添给2、3、4、5龄起蚕各160头食用,随后正常饲养至上蔟结茧、化蛹、羽化。检验死蚕、不结茧蚕、死笼茧及蛾子中菜粉蝶微孢子虫的感染情况。综合统计分析菜粉蝶微孢子虫对各龄期家蚕的危害性和感染的差异性。结果表明:菜粉蝶微孢子虫对家蚕不同龄期的感染力存在显著性差异,随着家蚕龄期的增加,菜粉蝶微孢子虫的感染力逐渐降低。