转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

 用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。     

Bt基因导入形态抗蚜棉研究

野生棉种多茸毛是一种形态抗蚜性状,其抗虫机理在于阻碍害虫特别是刺吸式害虫的取食,对幼虫的移动产生机械障碍作用,对棉蚜、棉叶螨、棉叶蝉、红铃虫等棉花害虫具有抗性。通过远缘杂交方式将野生棉种的多茸毛性状转育到栽培种陆地棉上,采用花粉管通道法将Bt基因导入形态抗蚜棉,获得转Bt基因形态抗虫棉纯合系;对纯合系2种害虫的抗性检测表明,通过转基因技术可以将高抗棉铃虫特性导入到形态抗蚜棉,但转化株系仍然保留了受体材料的抗蚜性状。表明通过远缘杂交与转基因技术可以实现多茸毛抗蚜性状与转基因抗棉铃虫性状的融合,并可有效解决棉花生产上的主要虫害。     

转基因抗虫棉抗虫性与农艺性状的关系

以5个不同来源的转Bt基因抗虫品种及原始受体品种为材料进行半双列杂交并构建6个F2分离群体,对半双列杂交组合、亲本和6个F2分离群体进行田间比较试验和抗虫性鉴定,分析转入Bt基因以后转基因品种抗虫性和产量性状、纤维品质的表现.结果表明:Bt基因为显性遗传,Bt基因的引入对于杂交组合的纤维品质不具有显著的影响,但对于铃数的增加具有显著影响;在不同F2分离群体中,转基因抗虫棉的校正死亡率与烂铃率显著负相关,相关系数为-0.259～-0.495,抗性的提高对烂铃数的减少、成铃数的增加具有显著作用;不同拷贝数的转基因抗虫杂交种抗虫性不存在显著差异,Bt基因不具有明显的剂量效应.     

双价抗虫转基因棉花研究

构建了携带人工合成的GFM CryIA杀虫基因和经过修饰的CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC。采用花粉管通道法,将pGBI121S4ABC转入到石远321、中棉所19号、3517和541中国棉花生产品种中,首次获得了双价转基因抗虫棉株系。叶片室内抗虫生物学鉴定表明,抗性好的株系棉铃虫幼虫校正死亡率大于96%;经分子检测,证实了双价杀虫基因在棉花基因组中的整合与表达。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

Bt转基因抗虫粳稻品种选育中若干问题研究

以Bt转基因水稻"克螟稻"为供体,与农艺性状优良的粳稻品种杂交,对杂交后代抗虫品种选育中GUS组织染色辅助选择、农艺性状选择对Bt基因纯合影响、混合选择与外源基因传递、及自然抗虫鉴定选择效果等方面作了研究,结果发现采用系谱法并结合GUS组织染色辅助选择的Bt转基因粳稻育种效果为最佳.经8代系谱选择,育成了3 个集高产和抗虫于一体的优良粳稻新品系.     

转Bt基因棉抗虫性的室内鉴定技术

从棉花种植、供试棉株器官选择、棉铃虫饲养、标准试虫选择、室内生测方法、抗性级别评价标准等方面 ,系统地总结了转 Bt基因棉抗虫性的室内鉴定技术。以从美国引进的转 Bt基因棉“保铃棉 32 B”为参考 ,对我国自行培育的第一个转 Bt基因棉“品种国抗棉 1号”的抗虫性进行了较系统的比较鉴定。     

Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的表达

[目的]评价转基因抗虫棉的生物安全性.[方法]利用3个由花粉管通道法获得的转Bt基因的抗虫棉品系,通过Southern杂交技术研究了抗虫棉的插入数,通过棉铃虫饲喂、半定量RT-PCR和ELISA测定了抗虫棉的Bt杀虫活性的时间和空间的动态变化.[结果]Bt基因在抗虫棉中为1～2个拷贝数;Bt蛋白杀虫活性的时空动态表现为在不同生育期的同一器官中,苗期叶片的表达比花铃期的叶片强,在同一生育期内,不同器官表达不同,叶片和铃壳的表达高于苞叶、花和雌雄蕊.[结论]Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的抗性具有时空表达特异性.     

陆地棉丰产品系与转Bt基因抗虫棉双列杂交配合力研究

以 4个陆地棉丰产品系和 4个转Bt基因抗虫棉品系为试材 ,采用双列杂交遗传设计 ,对 2 8个组合的F1进行田间观察和主要农艺性状配合力分析。结果表明 ,含有Bt基因的杂交组合其F1对棉小造桥虫为害的抗性为 0级 ,表明这一外源基因属显性质量性状。一般配合力分析表明 ,棉花主要 5个农艺性状主要受基因加性效应控制。特殊配合力方差分析表明 ,4个主要农艺性状的差异乃基因显性效应。 4个转Bt基因抗虫棉品系的 4个主要农艺性状的一般配合力效应值均为负值 ,表明其农艺性状与常规丰产品系存在一定差距。特殊配合力分析出现 5个优良组合。     

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。     

抗褐飞虱和抗除草剂转基因粳稻新品系的选育及其中间试验

利用根癌农杆菌介导法,将位于同一双元载体pCUGNA-BAR上的GNA基因和Bar基因导入粳稻品种广陵香粳,获得了转基因品系.经PCR扩增检测和Southern杂交分析证明GNA基因已整合到转化植株的基因组中.在转化后代中选育了一个表现优异的转基因水稻新品系3015-1-1进行中间试验,田间农艺性状调查发现该品系3015-1-1基本保持了未转化对照优良的农艺特性.抗虫和抗除草剂试验表明, 3015-1-1对褐飞虱的蜜露排泄量和繁殖率具有显著的抑制作用,对除草剂Basta有明显抗性.     

转Bt基因抗虫棉的筛选和抗性鉴定

2000～2002年采用卡那霉素叶片涂抹法和室内饲喂生物测定法筛选和鉴定转Bt基因棉原始群系"20-1"2代,对单株进行了抗虫性鉴定和抗性级别评价.在供试的321株材料中,筛选出特高抗棉株22株,高抗棉株19株,并将这些棉株的自交铃种子种成株行,进行了纯合株系(抗性基因纯合)的筛选,筛选出特高抗8个株行,高抗10个株行,可进行进一步的转Bt基因棉的品种选育.     

亲环素基因GhCYP1在陆地棉中的过量表达及耐盐性分析

通过农杆菌介导法将亲环素基因GhCYP1导入陆地棉棉花栽培品种中棉35中,经过卡那霉素抗性选择、PCR检测和系统选育获得5个不同转基因纯合系。在温室盆栽条件下,于3片真叶期对转基因棉花纯合系和非转基因对照进行200 mmol/L NaCl胁迫处理20 d。结果表明,转GhCYP1基因棉花株系比对照长势强,株高比对照提高2~5 cm,地上部分单株鲜质量比对照增加7.1%~12.4%,抗氧化物酶SOD,POD,CAT等的活性以及叶绿素含量显著高于对照。说明过量表达GhCYP1基因提高了陆地棉对盐碱的抗性。     

转Bt基因抗虫棉杂交后代的抗性表现与抗虫育种策略

以转Bt基因抗虫棉选系为抗虫亲本 ,以各种类型的陆地棉常规品种 (系 )为非抗虫亲本杂交 ,研究了大量杂交组合不同世代群体在大田自然感虫条件下的抗棉铃虫性表现。结果表明 ,F1代均表现高抗棉铃虫 ,抗性不分离 ;同一杂交方式不同非抗虫亲本的F2 群体 ,以及年际间 ,抗株与不抗株的分离比例相差很大 ,说明亲本的遗传背景及不同的环境条件对转Bt基因抗虫棉杂交后代的抗性表现有较大影响 ;从F3～F5株行 ,随着世代的递增和连续进行抗性选择 ,抗性纯合株行的比例迅速上升 ,而分离株行不抗虫株的比例迅速降低 ,在田间棉铃虫自然协迫条件下 ,通过连续多代进行抗性选择 ,可使抗性迅速趋于稳定 ,至F5代可获得综合性状较为理想、抗性纯合、稳定的株系。结合前期研究结果及抗虫育种实践 ,提出了棉花转基因抗虫育种策略     

Effects of insect-resistant transgenic cotton on ground-dwelling beetle assemblages(Coleoptera)

We compared the ground-dwelling beetle assemblages under four scenarios in which transgenic Bt(Cry 1Ac) cotton(33B),transgenic Bt(Cry 1Ac)+CpTI cotton(SGK321),conventional cotton(33),conventional cotton(Shiyuan 321) in North China.During the survey in two years(2009-2010),24 ground beetle species were captured with pitfall traps in 20 plots which included five replicates for each cotton type.No significant difference was observed in the number of ground beetle species captured,activity density,evenness and Shannon-Wiener diversity among the four cotton varieties.Chlaenius posticalis was less abundant in transgenic Bt+CpTI cotton(SGK321) fields than its conventional cotton(Shiyuan 321),but more abundant in transgenic Bt cotton(33B) fields compared with its conventional cotton(33).There was no significant difference for other abundant species between in transgenic cotton and in conventional cotton fields.Based on non-metric multidimensional scaling(NMDS) analysis,ground-dwelling beetle assemblages were similar in transgenic and conventional cotton over the two years,but the ground-dwelling beetle assemblages in transgenic cotton 33 B significantly differed from that in the conventional cotton(strain 33) in 2010.No strong evidence that the transgenic cotton effect on ground-dwelling beetle assemblages was found in this study.     

转CpTI基因不结球白菜的抗虫性表现

通过卡那霉素筛选、目的基因分子检测和生物学抗虫性鉴定 ,从转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因不结球白菜遗传工程植株自交后代中选育出抗虫性可遗传的纯合材料。用室内人工饲喂方法 ,以鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫为靶害虫 ,对转基因植株进行抗虫性鉴定。试验结果显示 ,转CpTI基因纯合材料对 1～ 2龄小菜蛾和斜纹夜蛾幼虫具有抗性 ,但不同株系间和同一株系内植株间的抗虫性程度差异较大     

转双价基因棉对高抗Bt棉棉铃虫的抗虫性

采用喂饲法，测定了转双价基因棉(中棉41、SGK321)、转单价基因棉(中棉29)及常规棉(苏棉12)对抗性和敏感棉铃虫的抗虫性。结果表明：转双价基因棉主茎叶片对抗性和敏感棉铃虫初孵幼虫的抗虫性明显高于或稍高于转单价基因棉，且随棉花生长发育期的推移抗虫性下降速度较慢，如第8叶后中棉41(ZM41)对抗性和敏感初孵幼虫的平均死亡率分别为80．0％～40．0％和100％～85．6％，而中棉29(ZM29)分别为30．0％～15．6％和84．0％～71．1％。转单、双价基因棉生长中后期主要受害部位对抗、感棉铃虫的抗性高低次序均为：嫩蕾、顶部嫩头、侧枝嫩叶，其中转双价基因棉嫩蕾对敏感棉铃虫和顶部嫩头对抗性棉铃虫的抗虫性显高于转单价基因棉。转单、双价基因棉对抗性棉铃虫的抗虫性低于敏感棉铃虫。     

Bt杀虫蛋白基因导入新疆棉花获得抗虫转基因植株

通过花粉管通道法将人工全序合成的Ｂｔ杀虫蛋白基因导入新陆早４号和Ｃ６５２４两品种中,收获注射地Ｂｔ杀虫蛋白基因的棉花种子２万余粒。经棉铃局喂的抗虫性生物检测,得到高抗虫的１８株新陆早４号转化苗和３６株Ｃ６５２４转化苗;以Ｂｔ基因的一对引物进行ＰＣＲ分析,５４株抗棉铃虫的转化棉花苗均扩增出部分Ｂｔ杀虫蛋白基因的目标带。未转化的对照棉花苗则无此条带,证实Ｂｔ杀虫蛋白基因已整合到转化抗虫棉株的染色体上,     

转Bt基因玉米杂交种的快速检测技术

采用快速小量的DNA提取技术,结合PCR技术,对84株转Bt基因的玉米杂交种的F2群体进行检测,结果表明73株呈现阳性,11株呈现阴性。幼苗移栽大田套袋自交,对4个F3家系进行了追踪检测证实,Bt基因在后代的分离符合孟德尔遗传规律,说明PCR技术直接用于转基因植物的鉴定是可靠的。