猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

猪圆环病毒2型吉林分离株的全基因组序列分析

采用PCR扩增1株吉林新分离的PCV2-2017全基因组序列,经过测序拼接后进行了序列分析。毒株PCV2-2017基因全长1 767 bp,在GenBank上进行同源性比对,同源性在96%～99%之间;与法国株AF055394同源性可达99%,与美国株AF055391、四川株HM102350同源性最低,为96%。PCV2中ORF1编码Rep蛋白,核苷酸和氨基酸同源性达到99%,ORF1突变很小,相对保守;ORF2基因全长为702 bp,编码Cap蛋白,氨基酸同源性达94%～99%,核苷酸同源性与美国株比对,可达96%,与法国株和国内部分毒株同源性达99%,是变异主要发生部位,共有12处点突变;ORF3编码蛋白,核苷酸同源性高达100%,说明变异不大。基因的遗传进化分析表明,PCV2-2017吉林新分离株全基因组与法国株AF055394亲缘关系最近,同属于PCV-2b亚型;与AY322001、AB426905和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393毒株亲缘关系较远。     

广东地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3感染情况的调查

对广东省不同地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3的流行病学情况进行调查。采集的病料样品,通过常规PCR进行PCV3检测与全基因扩增,分析其全基因的遗传进化关系。将获得的16株PCV3毒株核酸序列与其他环状病毒参考毒株对全基因组和Cap基因进行遗传变异分析,结果显示,新生仔猪的先天性震颤猪群中PCV3样本总阳性率高达58.2%。16株PCV3毒株之间全基因核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与美洲代表毒株PCV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%~99.1%之间;16株PCV3毒株之间Cap基因的核苷酸序列同源性为99.7%~100%,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为99.1%~100%。遗传进化分析显示,16株PCV3毒株都属于PCV3a分支。PCV3在我国广东省新生仔猪先天性震颤猪群中广泛存在。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的鉴定及全基因组序列分析

辽宁省某市猪场发生疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)传染性疾病,采集病死仔猪肺脏组织和淋巴结,经PCR检测、阳性产物测序、基因组分析,结果表明,该分离株为猪圆环病毒2型2 d基因型(PCV2d),命名为PCV-LNZh W1,全长1 767 bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为94.5%~99.9%,与PCV2d基因型的参考毒株位于同一遗传进化树分支。     

北京市猪场猪圆环病毒3型感染状况调查及其ORF2基因遗传进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。     

6株鸽源新城疫病毒广西分离株F基因的遗传演化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的6株鸽源新城疫病毒F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示:只有1株分离株F基因的ORF全长为1 659 bp,编码552个氨基酸,其他5株分离株F基因的ORF全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,6株分离株的F0蛋白裂解位点的序列均为112RRQKRF117,符合强毒株的序列结构特性;核苷酸同源性比较显示,6株分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为91.3%~99.3%(与比利时分离株11(JX901124)的同源性最高),与其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%~89.2%。与经典强毒株F48E9相比,核苷酸序列同源性为83.6%~84.8%,氨基酸序列同源性为89.2%~92.4%;与Ⅰ型疫苗株V4、I-2相比,核苷酸同源性分别为83.6%~85.1%和82.6%~84.2%,氨基酸序列同源性分别为88.1%~91.3%和87.7%~90.8%;与Ⅱ型疫苗株La Sota和B1相比,核苷酸同源性分别为81.7%~83.9%和82.0%~83.9%,氨基酸序列同源性分别为86.6%~89.9%和86.6%~89.9%。遗传进化分析显示,6株广西鸽源分离株与2011年比利时分离株11(JX901124)和中国毒株SDS、LLN713、BJP13、LJL404、P4的遗传关系最为接近,位于同一进化树分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

广东省猪圆环病毒2型基因的克隆与序列分析

根据Gen Bank已发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)全基因组序列,设计1对特异性引物,对广东省不同地区规模化猪场采集的临床诊断为断奶仔猪多系统消耗综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的组织病料进行了PCV2基因克隆和序列分析。结果表明,采集的PMWS病料均可扩增出PCV2完整基因序列,与Gen Bank已发表的PCV2参考毒株序列核苷酸同源性达93.7%~99.8%,亲缘关系密切。其中10个PCV2基因全长1767 bp,属于PCV2b亚型,1个PCV2基因全长1768 bp,属于PCV2a亚型。     

湖北地区猪瘟病毒流行株E2基因的序列测定与分析

为分析猪瘟病毒湖北流行株(CSFV-HBWH-2017株)E2基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的CSFV-E2基因序列设计特异性引物,对CSFV-HBWH-2017株E2基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示,E2基因PCR扩增产物大小为1 489 bp,编码496个氨基酸,系统进化树显示HBWH-2017株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为86.0%~96.0%,与湖南HNLY-2011株同源性高达96%亲缘关系最近,属于同一分支2.1c亚型,表明2.1c毒株已经成为湖北地区流行毒株。     

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。     

猪圆环病毒2型山西分离株的遗传变异多样性分析

为了进一步研究山西猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异多样性情况,对山西2013—2016年间分离的9株猪圆环病毒流行株(SXQX、SXCZ、SXJC、SXJX、SXLL、SXPY、SXPG、SXXY、SXTY2株)的全基因组进行了扩增、克隆和测序,已收录入GenBank中。并将其全基因序列、ORF2序列和推导出的Cap蛋白氨基酸序列与不同国家和地区的28株主要流行株进行了遗传变异多样性分析,结果显示:9株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJX、SXXY、SXJC株为1 768bp,其余均为1 767bp,分别约占33%和67%。9株PCV2流行株之间核苷酸同源性为94.7%~99.8%,与国内外28株参考株同源性为93.9%~99.9%,与国产疫苗株同源性(LG、DBN-SXO7-2、SH株)为95.1%~99.8%;PCV2全基因组序列的进化分析表明:本试验分离的SXJX、SXJC、SXXY株属于PCV2a亚型的2D亚群,SXLL、SXPY、SXCZ株属于PCV2b亚型的1C亚群,SXTY14、SXQX、SXPG株属于PCV2b亚型的1A/1B亚群,可见近几年,山西PCV2流行株以PCV-2b亚型为主。分离的9株PCV2的ORF2之间核苷酸和Cap蛋白氨基酸同源性分别为90.0%~100.0%和87.1%~100.0%,与28株参考株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为87.6%~100.0%和84.1%~100.0%,与国产疫苗株核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为91.0%~100.0%和89.3%~100.0%,同源性都较高。9株分离株中,有6株分离株(SXQX、SXTY14、SXPG、SXXY、SXJC、SXJX)Cap蛋白氨基酸为233个,其中SXQX、SXTY14、SXPG株的ORF2位于1 033~1 734bp,SXXY、SXJC、SXJX株的ORF2位于1 034~1 735bp,3株分离株(SXCZ、SXLL、SXPY)Cap蛋白氨基酸为234个,其ORF2位于1 030~1 734bp,而与其他基因组序列为1 767bp分离株的ORF2相比,1 030~1 734bp位置多了3个碱基TCA,导致其氨基酸序列在234位置增加1个K(Lys)。另外还发现9株PCV2Cap蛋白除了唯一糖基化位点(NYS)(第143~145位氨基酸)呈高度保守外,还存在较多的氨基酸变异,这为山西地区PCV2的免疫预防等的研究提供理论依据,并为深入开展PCV2的分子致病机理提供基础理论数据。     

猪圆环病毒2型青海分离株的分子鉴定及进化分析

本研究对青藏高原地区猪圆环病毒青海分离株(PCV2-QH1)进行了Cap基因的克隆鉴定及测序分析,并与我国及其他国家或地区的毒株进行了同源性比较和遗传进化分析。结果显示:PCV2-Cap基因核苷酸序列全长705 bp,编码蛋白为234个氨基酸,分子量大小约28.06 k Da,为不稳定蛋白,总体亲水性非常高,可溶于水;PCV2-Cap蛋白二级结构以无规则卷曲为主,有多个有效的抗原表位;PCV2-QH1分离株与其他参考序列的核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上;PCV2-QH1分离株与PCV2美国分离株(KU697156)组成一个微小分支,并与美国毒株、韩国毒株聚在一支,表明它们之间的亲缘关系最近。本次对青海分离株PCV2-QH1的鉴定,可为我国猪圆环病毒分子流行病学调查提供数据参考。     

猪圆环病毒2型北京株的分离及基因组序列分析

为了解北京地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2010年病料中分离的2株PCV2通过PCR、IPMA进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar进行序列分析,用MEGA5进行PCV2ORF2序列比对,构建系统进化树。结果表明,分离得到的BJ2010LC株(登录号为JQ002671)、BJ2010PG株(登录号为JQ002672)2个PCV2毒株其全基因组长度均为1 767bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为94.2%～99.5%,2个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.6%。BJ2010LC株属于基因型PCV2d,BJ2010PG株属于基因型PCV2b。     

猪圆环病毒2型贵州株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采自贵州长顺、清镇和仁怀地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病料进行了猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组扩增、克隆和测序分析。结果表明:所扩增克隆的3株PCV2中,GZ-QZ1(JQ809463)和GZ-RH1(JQ809464)2个PCV2毒株基因组全长为1 767 bp,GZ-CS1(JQ809462)株为1 768 bp;3株PCV2之间的核苷酸序列相似性介于94.5%⁹9.9%,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为93.6%99.9%,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为93.6%⁹9.9%;全基因组序列比对分析表明,GZ-QZ1和GZ-RH1两个毒株属于PCV2b,GZ-CS1株属于PCV2a。对3株病毒编码Cap蛋白的ORF2基因分析发现,GZ-QZ1和GZ-RH1毒株与GZ-CS1毒株相比在696位缺失了一个碱基A,导致移码突变,使得末端氨基酸序列变由L K P变为L N P R。     

10株广西猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列的遗传变异分析

为了解广西猪群猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以PCV3阳性DNA为模板,利用PCR的方法分2段扩增PCV3全基因序列并进行拼接,获得10株PCV3全基因组序列,全长均为2 000 bp。10株广西PCV3全基因组序列之间的核苷酸同源性为98.6%～99.8%。与国内其他毒株的同源性为97.9%～99.8%;与国外其他毒株的同源性为98.8%～99.7%。10株广西PCV3 Cap基因的大小均为645 bp,编码214 aa。PCV3 Cap基因比较保守,10株广西PCV3 Cap基因与参考株相比,仅存在散在的突变位点。基于PCV3全基因和Cap基因构建的遗传进化树显示,两者结果基本相同,10株广西PCV3处于3a和3b两个亚群。本试验表明,广西地区猪群中流行的PCV3至少存在2个亚群,不同亚群PCV3毒株的致病性差异还有待进一步的研究。     

猪圆环病毒2型河北株的全基因组克隆与序列分析

采用降落PCR方法对采集自河北地区的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病料进行猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组的扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,分别命名为BD株和SJZ株,对其进行克隆、测定后,应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示:BD株全基因为1 767 bp,与黑龙江的BHD株同源性高达99.8%,SJZ株全长为1 768 bp,与北京的BJ株同源性最高为99.5%;对分离毒株与5个不同基因亚型的15个参考株的PCV2全基因组序列进化分析表明,发现分离的BD株为PCV2d亚型。     

猪圆环病毒2型广东分离株的遗传演化分析

为了解广东地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异情况,从广东不同地区的规模化猪场采集疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪的淋巴结、肺脏和脾脏。对PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上增殖培养6代,采用PCR和相关分子生物学软件对12个分离株进行全基因组克隆和测序分析。结果显示,分离株基因组全长为1 767 nt或1 768 nt,核苷酸序列同源性为94.6%~99.9%。遗传演化分析表明,12个分离株分布于3个大群,其中5株属于PCV2b,4株属于PCV2d,3株属于PCV2e,提示广东地区PCV2流行毒株已发生变化。     

新城疫病毒西藏分离株HN基因克隆与序列分析

为确定西藏新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性,本试验应用RT-PCR技术对西藏NDV分离株HN基因进行扩增,然后克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外代表性毒株和当前疫苗株进行比对及系统发育分析。结果表明,NDV分离株HN基因片段长度为1734 bp, 编码577个氨基酸;推导的氨基酸序列均有5个糖基化位点, XZ10和XZ17有12个半胱氨酸残基,XZ20只有11个半胱氨酸残基。NDV西藏分离株HN基因与国内代表性毒株核苷酸同源性在81.1%~93.0%之间,氨基酸同源性在81.1%~93.6%之间;与疫苗株核苷酸同源性在87.8%~98.7%之间,氨基酸同源性在88.0%~98.9%之间。系统进化分析结果表明,NDV西藏分离株HN基因均属于Ⅱ型。