鉴别猪伪狂犬病毒强毒检测方法的研究进展

为有效配合猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗的大规模免疫应用,准确区分强毒感染猪和疫苗接种猪,及时淘汰强毒感染猪,防止免疫猪被误杀,急需加强猪伪狂犬病强毒鉴别诊断方法的研究与推广应用。本文就近年来针对PRV强毒的PCR、荧光定量PCR、LAMP、核酸探针、ELISA、胶体金免疫技术等分子生物学与血清学诊断方法的研究与应用现状及发展前景进行综述,以期为我国猪伪狂犬病的综合防控及净化提供合理的科学依据。     

江山市猪伪狂犬病的流行现状与防控建议

正猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的高度传染性疫病~([1])。我国通过广泛推广应用PRV gE基因缺失疫苗以及配套的鉴别诊断技术曾一度有效控制了PRV的流行,但自2011年以来,PRV变异毒株开始在全国猪场陆续暴发流行,其抗原性发生了改变,毒力和致病性均显著增强,传统疫苗对其不能提供完全保护~([2]),业界甚至普遍认为PRV将成为很长一段时间内严重威胁我国养猪产业的主要     

猪伪狂犬病毒野毒株套式PCR检测方法

为建立能鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒株和疫苗株的实用方法,本文以疫苗株缺失的3.5kb片段为靶基因,设计了2对PCR引物,建立了能够特异性检测PRV野毒株的套式PCR方法。与常规PCR相比,该方法检测极限可达10个病毒拷贝/μL,是常规PCR的1000倍,并与猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象。在对临床150份样品检测时,套式PCR的阳性率为21.33%,常规PCR的阳性率为10%。这表明该方法具有特异性高、敏感性强的特点,是一种值得基层推广应用的快速诊断技术,可用于PRV的诊断和流行病学调查等。     

鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒双重PCR检测方法的建立

依据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)基因序列,分别设计了g E和g H两对引物,以PRV闽A株、Bartha(g E-)株和Norden(Tk-)株为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗毒株的鉴别PCR方法。该方法能从PRV闽A株、Norden(Tk-)株中扩增出一条355 bp的条带,但Bartha(g E-)株没有扩增出该目的条带。对正常细胞、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应。在对单项PCR反应条件(引物浓度、Mg~(2+)浓度、退火温度等)优化的基础上,建立了鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的双重PCR检测方法,并分别用双重PCR和单项PCR检测15份临床病料,两者符合率为97.5%,表明该双重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。     

山东省某规模猪场猪伪狂犬病毒变异毒株的分离与鉴定

2015年山东省烟台市某免疫伪狂犬病疫苗Bartha-K61猪场暴发疑似伪狂犬病疫情,临床表现为妊娠母猪繁殖障碍,仔猪神经症状。脑组织病料样品接种BHK21细胞,分离获得1株伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-YT株。该病毒株gE基因与JS-2012、HN1201和ZJ01株序列同源性为99.4%～99.8%,且位于同一遗传进化分支。选择70日龄PRV阴性健康猪接种PRV-YT株,发病率和死亡率均达100%(5/5),均表现严重脑组织、肝脏与肺脏损伤,表明PRV-YT株为猪伪狂犬病病毒变异强毒株。本研究为制定猪伪狂犬病防控方案提供了重要基础。     

新型猪伪狂犬病流行情况及净化措施

2011年11月份我国发生新型猪伪狂犬病疫情,导致中大猪、母猪出现典型的伪狂犬症状而死亡。目前,各地分离到的猪伪狂犬病毒(PRV)流行毒株基因组同源性非常接近。通过PCR检测新分离的伪狂犬病毒,测序后发现毒株出现基因变异,与Bartha株比较,其毒力相关基因RR基因第31~36位出现6个连续碱基的缺失,免疫原g B基因的第224~232位发生9个碱基GCCCCGGCC的缺失。毒力基因的变化导致PRV毒株的毒力明显增强。针对我国新型猪伪狂犬病的流行情况、发生原因以及该病对我国养猪业造成的危害进行了分析讨论,对新型伪狂犬病的毒株变异现象、临床新表现、病理新变化以及诊断方法作了阐述,并提出了新型伪狂犬病的防制和净化措施。     

猪伪狂犬病的防控策略及净化方案

正猪伪狂犬病(Pseudrabies,PR)是伪狂犬病病毒(Pseudrabies Virus,PRV)所引起的猪的一种病毒性传染病。猪PRV被确认为猪甲型疱疹病毒,为双链DNA病毒。1902年匈牙利奥杰斯基首次报道,因此又称奥杰斯基病病毒。迄今,从世界各地分离的毒株均呈现一致的血清学反应,即只有一个血清型,但毒力有强弱之分,毒株的致病性有差异。     

猪伪狂犬病诊断检测方法研究进展

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(PRV)引起,最早发现于美国,因临床表现与狂犬病类似,故称伪狂犬病。该病在全球范围内的流行呈上升趋势,世界上已有50多个国家和地区报导该病的流行。我国自1947年刘永纯从猪体分离到PRV以来,已有24个省(市)、自治区报导流行。本文主要对血清学、分子生物学诊断与检测方法,以及鉴别诊断方法进行了综述。     

山东省免疫猪场猪伪狂犬病病毒分离鉴定及gE毒力基因的序列分析

为了解山东省使用Bartha-K61疫苗免疫猪场猪伪狂犬病(PR)流行的原因,本研究对2013和2014年采自山东省免疫猪场的PR疑似病料进行了猪伪狂犬病病毒(PRV)的分离鉴定,并对分离毒株的毒力基因gE进行了序列测定与分析。结果表明,共分离到12株PRV,TCID50介于10~(-7.1)/0.1mL与10~(-9.5)/0.1mL之间。12株PRV的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.9%~100.0%和99.7%~100.0%;与亚洲毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株。gE基因的氨基酸进化树分析表明,包括本研究分离的12株PRV在内的所有42株亚洲毒株属于GⅠ型,所有欧美毒株属于GⅡ型。这2个基因型之间分别在第58,105,148,178,180,214,215,470,500,505,518,522,569位氨基酸存在明显差异,可作为鉴别PRV欧美毒株与亚洲毒株的遗传标志。     

猪伪狂犬病免疫研究进展

<正>伪狂犬病(Pseudorabies,PR或Aujeszky Disease,AD)是感染伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的B类传染病(OIE认定)。该病毒可以感染除短尾猿以外的几乎所有哺乳动物,猪是唯一的自然宿主。猪感染伪狂犬病的损失和伪狂犬病病毒毒株     

猪伪狂犬病野毒抗体检测

猪伪狂犬病病毒(PRV)感染是造成养猪业重要经济损失的主要疾病之一.目前,由于PRV基因缺失疫苗的推广使用及其鉴别诊断方法的建立,该病的危害大大减轻,但PRV野毒感染仍然存在.     

伪狂犬病毒流行毒株的抗原性和血清中和特性分析

2011年以来,我国多个省份伪狂犬病免疫猪群相继暴发伪狂犬病疫情。为了探明伪狂犬病毒(PRV)流行毒株是否存在抗原变异,本研究从3个规模猪场3种PRV商品疫苗免疫的健康猪群中采集30份血清,经检测PRV gB ELISA抗体均为阳性,gE ELISA抗体均为阴性。采用PRV新流行毒株ZJ-01株和传统的LA毒株分别进行血清中和抗体测定,结果显示,3个毒株活疫苗免疫血清与ZJ-01株中和抗体效价明显低于其与LA株中和抗体效价。同时,ZJ-01株抗血清与ZJ-01株和LA株的中和抗体效价相似,其变异系数R值为0.279⁰.413,证明PRV分离毒株ZJ-01抗原性发生明显变异。本研究为伪狂犬病的防控提供了重要依据。     

猪伪狂犬病毒野毒感染的PCR检测方法建立及应用

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、gB基因序列,设计并合成了2对特异性引物,以PRV容A株细胞培养毒为模板,通过对PCR扩增条件的优化,建立了区分PRV野毒株和疫苗毒株的双重PCR方法。该方法能从野毒株基因组中同时扩增出2条大小分别为400bp(gE基因)、582bp(gB基因)的特异性片段,从疫苗毒DNA中仅扩增出1条大小为582bp的片段。试验证明所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,对临床上20份PRV感染疑似病料进行检测,双重PCR检测的结果与单重PCR检测结果总体符合率为100%,表明所建立的双重PCR检测方法可用于猪伪狂犬病野毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

我国猪伪狂犬病变异株研究概况

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的、严重危害养猪业的一种烈性传染病。在过去的几十年里,我国通过在猪群中广泛使用Bartha-K61株基因缺失弱毒疫苗,使PR得到了有效控制。但自2011年以来,在全国范围内,许多Bartha-K61疫苗免疫猪群出现了PR疫情。研究证实,该疫情是由PRV变异株引起的,与以往毒株相比,PRV变异株致病性明显增强,且Bartha-K61疫苗不能对猪只提供完全的免疫保护。目前针对PRV变异株的疫苗正在研制中,其中基因缺失活疫苗能够对当前流行的PRV变异株提供完全的免疫保护,这些疫苗大多处于转基因安全评价阶段。在诊断方法上,已经建立了能够有效区分Bartha-K61疫苗株、PRV经典强毒株和当前流行的变异株的三重荧光定量PCR方法。利用安全有效的基因缺失疫苗和配套的鉴别诊断技术,并结合有效的生物安全防控措施,对PR进行净化,是未来必由之路。本文对我国当前PR的流行病学、诊断方法、疫苗研制和防控策略等进行了简述和讨论。     

应用PCR技术检测伪狂犬病病毒

根据伪狂犬病病毒(PRV)的gE基因序列,设计并合成了一对引物,以闽A株DNA为模板,建立了检测PRV的PCR方法。该方法能从猪细小病毒闽A株和FB株中扩增出一条长度为1 808 bp的片段,对Bartha株、gE-株检测为阴性;而以猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和正常细胞的核酸为模板的均为阴性;敏感性试验表明,该体系可检测到10pg的猪细小病毒基因组DNA。表明该方法适用于检测猪伪狂犬病病毒野毒株或非gE基因缺失弱毒株。     

某规模化猪场伪狂犬病的诊断

河南平顶山某猪场母猪出现较严重的流产和产死胎现象,且50日龄~70日龄仔猪出现神经症状,根据临床表现初步诊断为伪狂犬病。为排除猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟,进行了实验室诊断。应用ELISA方法检测发病保育猪及母猪血清的伪狂犬病病毒野毒株gE抗体,并对发病仔猪病料进行了伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光定量PCR检测。结果显示,伪狂犬病病毒野毒抗体阳性,实时荧光定量PCR检测确定仔猪病料中PRV核酸阳性,PRRSV和CSFV核酸阴性。结合临床症状及实验室检测,确诊该猪场发生的是猪伪狂犬病。     

PCR结合核酸斑点杂交检测猪伪狂犬病毒

本研究基于猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)gE基因,建立了一种PCR结合核酸斑点杂交检测方法来鉴别野毒株和疫苗株,并利用这一方法对山东省部分地区的猪临床病料中PRV进行了检测。结果显示,建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法只与PRV野毒株反应,而与PRV gE基因缺失疫苗、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒2型不反应。PCR结合核酸斑点杂交方法在53份病料中检出PRV阳性病料5份,阳性率为9.43%,高于单纯PCR的检出率(7.55%)。结果表明,本研究建立的PCR结合斑点杂交的方法特异性强,灵敏度高,适合PRV野毒的检测以及流行病学调查,可应用于PRV的鉴别诊断和净化。     

猪体内伪狂犬病毒分布及其神经示踪启示

<正>伪狂犬病(Pseudoraies,PR)是当前国内猪群中重要的疫病之一,掌握PRV在猪体内的分布规律有利于理解猪感染PRV后发生的病理过程、指导临床病理诊断和取样;理清PRV作为神经示踪物在实验动物神经系统中的循行特点将有助于理解PRV疫苗毒株和野毒株对猪的侵染机制,并启示猪神经症状出现前PRV的可能循行路线,帮助业者探究现场猪群最初感染PRV的可能途径,制定更合理的免疫程     

伪狂犬病病毒gE／gB PCR鉴别方法的建立及其应用

为了检测伪狂犬病病毒(PRV)潜伏感染及确定病毒潜伏的主要部位，建立了能鉴别PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株gE／gB的PCR诊断方法。结果表明，所建立的PCR特异性强、敏感性高、稳定性好，能用于病毒潜伏感染的检测；同时还确定PRV潜伏感染的主要部位是三叉神经节、扁桃体、嗅球、脑干、脑桥和咽黏膜。