番茄果实特异表达启动子ESp1的克隆及表达

E8启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因E8的启动子区。这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件，调节E8基因在果实成熟过程中表达（Deikmaa et al．，1998）。本研究根据GenBank中E8基因的启动子区序列设计引物，从番茄基因组中克隆了该启动子，构建了番茄果实特异表达载体，并通过RT-PCR和gus基因检测了该表达载体的果实特异表达活性。     

番茄果实特异表达启动子E8p1的克隆及表达

E8启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因E8的启动子区。这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件,调节E8基因在果实     

花特异表达启动子PchsA的克隆及其序列分析

根据Ingrid M报道的矮牵牛花特异表达基因CHS A启动子的序列设计并合成一对特异引物，以矮牵牛（Petunia hybrida）叶片总DNA为模板，通过PCR扩增获得约含0.5kb大小的DNA片段，回收该片段并克隆到pGEM^R-T Easy载体上，进行测序，该片段含514bp。采用pcgene软件进行启动子序列结构的分析，第401－407之间有一个TATA box，第52－62位碱基间有一个CCAAT box，第429－434之间有一戴帽位点（cap site)，第21－36个碱基间有一个anther blox，第303－320位碱基间有一个box2元件，第335－349位碱基间有一个box1元件，box1元件内包含有一个G－box，第362－267之间还有一下G－box，第370－382之间有2个拷贝的TACPyAT box，所有这些调控元件及其附近的序列与报道的序列完全一致。但该序列在第78－248个碱基间比报道序列多出一段171bp的序列，经Splice site prediction分析，在第146－250bp之间为一内含子的序列（105bp)。     

拟南芥花药特异启动子启动的Barnase基因在烟草中的表达

为探明植物基因工程雄性不育温度敏感性的影响因子，以拟南芥（Arabidopsis thaliana)WS生态型基因组DNA为模板，PCR扩增后分别得到0.78kb的A6和0.3kb的A9基因5'旁侧区DNA片段。将其分别与核糖核酸酶Barnase基因融合，导入含有抗溴苯腈（Bxn)基因的植物双元表达载体构建成pWPA6N和pWPA9N，并经根癌农杆菌（Agrobactrium turmefaciens)LBA4404介导获得转基因植株。生物学观察表明，转基因植株表明出了明显的转化不育性状，如花丝变短，花药瘦小等，说明A6，A9两5'启动子片段都在烟草（Nicotiana abacum)花药中定位启动了Barnase的表达，另经高温敏感性测试均可见育性恢复现象,这初步表明雄性不育植株的高温不稳定性由启动子造成的可能性较小。     

T7RNAP基因的克隆及其质体定位表达载体的构建

为在番茄成熟果实组织中建立T7/T7RNAP质体转基因特异与高效表达系统,本文克隆了原核T7RNAP基因,在添加上质体定位信号肽编码序列后,由番茄果实成熟特异表达启动子PDS和Tnos终止子控制,构成了含有PDS-ptT7RNAP-Tnos基因表达盒的植物基因双元表达载体。该研究为在番茄质体工程中控制外源质体转基因在番茄成熟果实成熟组织中定点表达奠定了基础。     

水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻（Oryza sativa）中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析

叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。     

一个水稻鞘叶特异表达启动子的克隆及功能鉴定

目前在基因工程中应用最广的为组成型启动子,但是组成型启动子驱动外源基因在各组织中持续恒定的表达可能引起植物发育迟缓等问题,因此克隆来源于作物本身的组织特异型启动子逐渐受到重视。根据本实验室基因芯片数据库找到一个在水稻绿色组织特异表达的基因(TIGR Locus:LOC_Os06g21110),用 PCR 技术从水稻明恢 63(Oryza sativa L ssp. indica)基因组中克隆得到其上游启动子命名为GSP (green-tissue specific promoter),长度为1 951 bp。将GSP与带有β-glucuronidas(gus)报告基因的的植物表达载体连接,经农杆菌(Agrobacterium)介导转化水稻中花11 (O. sativa L ssp. japonica)成熟种子胚诱导的愈伤组织,获得转基因水稻阳性植株,通过组织化学染色法证明,GSP是一个叶鞘和叶片特异表达启动子。对其进行5’端缺失分析,构建了7个缺失载体,通过验证缺失载体的表达谱,证明592 bp长度的启动子就足以维持鞘叶特异表达模式,初步鉴定出了该启动子的核心功能区域。本研究所克隆出的GSP 启动子是一个未曾报道过的鞘叶特异表达启动子,基因工程中利用此类启动子可以在改良水稻性状的同时减少对水稻生理方面的副作用,有良好的应用价值。     

烟草花药特异启动子的克隆,活性测定及雄性不育基因和恢复基…

采用聚合酶链式反应方法（ＰＣＲ），以烟草叶片ＤＮＡ为模板扩增得到１．５ｋｂ花药特异启动子ＴＡ２９的基因片段。然后克隆到ｐＧＥＭ７２ｆ（＋）的ＳｍａＩ位点上。序列分析结果表明，该基因片段两端２８０ｂｐ区段的碱基序列与资料报道的完全相同。经转化离体组织测定，该启动子具有花药特异启动活性。该启动子经与核酸酶Ｂａｒｎａｓｅ及其相应的抑制剂Ｂａｒｓｔａｒ基因分别融合后构建成雄性不育基因和恢复基因。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

番茄果实中NEVER—RIPE基因的克隆及其反义表达载体的构建

从粉红期番茄果实中提取总RNA，根据Genebank中NEVER－RIPE（即NR基因）cDNA序列，设计合成特异性引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得一个715bp左右的扩增产物，克隆于pGEM-T easy载体，测序确定其正确性。将该扩增产物反向克隆到植物表达载体pBI121中，通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

玉米Ubi-1启动子驱动挪威鼠Hspa4基因植物表达载体的构建

根据Genbank中挪威鼠（Rattus norvegicus）Hspa4基因序列(登录号：NM 153629)和玉米Ubi-1启动子序列(登录号：DQ141598 )设计引物,采用RT-PCR和PCR技术分别进行克隆。测序及同源性分析结果表明：Hspa4基因片段含有2530bp,编码840个氨基酸;获得的启动子Ubi-1序列大小为1992bp;克隆的序列与相应原序列同源性分别为99.96％和99.55%。以植物表达载体pCAMBIA1301质粒为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi-Hspa4,为利用Hspa4基因改良植物抗逆性打下了基础。     

甘蓝型油菜柱头特异启动子的克隆和序列分析

芸薹属自交不亲和相关基因SLR1只在柱头中特异表达，根据已知的SLR1基因启动子序列设计特异引物，用PCR法从几个甘蓝型油菜品种和品系中分离得到相应的启动子片断，进行序列比较分析后，并构建它们与GFP融合的植物表达载体，转化拟南芥，验证所分离到的启动子的时空特异性。研究表明，来自自交不亲和羽衣甘蓝和来自自交亲和的甘蓝型油菜的SLR1启动子具有相似的序列结构和相同的组织特异表达功能。该结果将为下一步研究S-locus基因在甘蓝型油菜中的表达和相互作用奠定基础。     

ToMV番茄坏死株系农杆菌侵染性克隆构建及其表达

番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员,该病毒侵染严重影响农作物的产量和质量。ToMV-N5株系能引起番茄(Lycopersicon esculentum)主栽品种(合作903)系统性坏死,建立该株系的侵染性克隆体系是研究其致病机理的必要条件。本研究将ToMV-N5株系的基因组克隆至含35S启动子瞬时表达载体pCB301中,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)和番茄结果表明,农杆菌侵染性克隆pCB301-ToMV-N5引起本氏烟和番茄系统性坏死症状,与其病毒粒子摩擦接种所引起的症状相一致。以绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)代替ToMV-N5的外壳蛋白基因(coat protein,CP)获得表达载体pCB301-ToMV-N5CP45GFP,病毒接种结果表明,ToMV-N5能高效表达GFP,在病毒浸润接种浓度(OD600)为0.002时,GFP也能够有效表达。pCB301-ToMV-N5CP45GFP缺失了CP基因使得病毒不能系统性侵染,将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)U5株系包含CP大小为647 nt(nt 5 498~6 145)片段克隆到pCB301-ToMV-N5CP45GFP中,获得pCB301-ToMV-N5CP45GFP-CPU5,浸润接种本氏烟结果表明,病毒能长距离移动,在寄主非接种部位表达GFP;浸润及摩擦接种番茄结果表明,只能在显微镜下观察到微弱GFP,且局限于接种部位。本研究成功获得了ToMV-N5株系的农杆菌侵染性克隆及其表达载体,为研究该病毒侵染的分子机理提供了基础资料。     

花生果种皮发育相关特异基因的克隆和表达分析

本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出了一个255bp的EST序列并进行了研究。构建了花生果种皮全长cDNA库并从中筛选出该基因的全长,命名为AhPSG8。此基因全长1118bp,开放阅读框第33～833个碱基,编码266个氨基酸残基组成的多肽。由生物信息学分析表明该基因编码多个活性位点蛋白,可能与细胞内DNA的转录有关;结构分析揭示出AhPSG8具有一个跨膜区,N端是一个由20个氨基酸组成的信号肽;该基因与已发表的基因序列没有明显的同源性,为一新基因;RT—PCR研究该基因在花生中的表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,10～40d果皮中丰富表达,推测为与花生果种皮发育相关基因。     

马铃薯叶片特异性启动子克隆分析及其驱动的人白细胞介素-12表达载体构建

利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究热点。本研究利用PCR技术从马铃薯基因组中克隆其叶片组织特异性启动子Prbcs后,利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析,接着通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Prbcs驱动的药用蛋白人白细胞介素12（hIL12）表达载体。结果显示,本研究成功从马铃薯基因组中扩增得到了623 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Prbcs驱动的hIL12植物表达载体。本研究获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础。     

植酸酶根特异表达载体的构建及大豆转化

应用PCR方法分别从胡萝卜基因组中扩增出96bp的外展蛋白信号肽编码序列片段,从拟南芥基因组中扩增出1454bp的pyk10启动子片段,用RT-PCR方法从无花果曲霉（Aspergillus ficuum3.4322）中扩增出phyA基因,长1347bp。然后,分别克隆到pMD18-T载体。应用已设计的限制酶切位点,通...