枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B(Gen Bank登录号AY340789)在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌(Bs916/p XYNB2),并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0~5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6~7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。     

微生物的木聚糖酶及其生物漂白研究进展

微生物用来代谢木聚糖的酶系是研究自然界中第 2种最丰富的多聚糖 (木聚糖 )的重要工具 .近年来 ,国际上对微生物分解木聚糖系统的研究日益关注 ,主要研究工作集中在不同条件下微生物木聚糖酶的诱导产生和调节机制 ,酶的提纯、鉴定 ,木聚糖酶基因的分子克隆和表达 ,以及木聚糖酶在加工工业上 ,尤其是纸浆漂白方面的应用 .该文综述了木聚糖复杂的结构 ,微生物木聚糖酶的生物合成、固定化、固态发酵、酶的协同作用、基因的分子克隆以及其潜在的应用价值 ,并简要综述了微生物木聚糖酶的生物漂白机制、选择标准以及木聚糖酶技术的应用前景 .     

嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变

为了进一步提高嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus DSM10635)本已较耐热的木聚糖酶1YNA的热稳定性。利用重叠延伸PCR技术从嗜热真菌基因组DNA中扩增获得了木聚糖酶1YNA的基因xyl,将其插入到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中,构建了重组表达质粒pET-22b(+)-xyl。该质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后获得了能成功表达的工程菌。工程菌表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃,最适pH值为6.0。其在75℃,pH值为6.5的条件下失活处理30min后还残存有30%的酶活,与嗜热真菌生产的木聚糖酶特性相近。在对该木聚糖酶的N端氨基酸序列进行定点突变后发现,T4A、T4G、T4R均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响,其中T4G突变体的耐热性有变弱的趋势。     

大肠杆菌重组菌生产极端耐热木聚糖酶的研究

将含有来自于嗜热网球菌 (Dictyoglomusthermophilum)Rt4 6B .1编码极端耐热木聚糖酶基因xynB的表达载体pET -DBc转化大肠杆菌EscherichiacoliBL2 1(DE3) ,获得重组菌E .coliDB1,目的基因可表达出有活性且耐 90℃的木聚糖酶。E .coliDB1发酵培养基的较佳组成为 (g/l) :葡萄糖 5 0 ,NH4Cl 3、MgSO40 .5、CaCl2 0 .6、Na2 HPO4·7H2 O 12 .8、KH2 PO43.0和NaCl 0 .5。在工程菌培养的对数生长前期加入终浓度为 1mmol/l的异丙基硫代 - β -D -半乳糖苷 (IPTG)进行诱导 ,对菌体生长无阻碍作用 ,木聚糖酶酶活在菌体生长的后期达到最高 ,利用优化的培养基在不加入IPTG的情况下木聚糖酶酶活仍维持在很高的水平。     

红色亚栖热菌耐热木聚糖酶的克隆表达及生物信息学分析

从自主分离的Meiothermus.rubber菌株的基因组中克隆到木聚糖酶基因,并进行了超量表达、重组酶的纯化和酶学性质研究。结果表明,重组木聚糖酶Mru是热稳定性酶,最适反应温度为65℃,能够有效降解木聚糖产生木糖和木二糖。生物信息学分析发现,木聚糖酶Mru与数据库中来自亚栖热菌的木聚糖酶的同源性为60%~100%。在木聚糖酶Mru的结构模型中,GH10木聚糖酶的保守位点大多位于β折叠,α螺旋保守性很低。本研究揭示,木聚糖酶Mru代表一类新型热稳定性GH10木聚糖酶。     

利用pHsh载体克隆与表达多功能半纤维素酶

将来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)基因构建到新型热激质粒pHsh上,得到质粒pHsh-xarB。将来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus DSM5826)的木聚糖酶A(XynA)基因构建到pHsh-xarB上,得到表达质粒pHsh-xarB-xynA。将重组质粒pHsh-xarB-xynA转入大肠杆菌Escherichia coli JM109进行表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为108 000,与理论值相符。Xyn-SDS-PAGE显示该融合酶具备木聚糖酶的活性。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性好,这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。     

木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达

【目的】构建木聚糖酶（XynB）与甘露聚糖酶（ManA）的融合酶基因,使其能在哺乳动物表达系统中表达并分泌兼有木聚糖酶和甘露聚糖酶活性的双功能融合酶。【方法】利用基因融合技术（SOE-PCR）,把 11条Linker融合到木聚糖酶（XynB）和甘露聚糖酶（ManA）基因间,构建真核表达载体,经转染猪肾细胞（pK15）收集细胞培养液,用DNS法测定其酶活并进行酶学分析。【结果】经表达分析12条不同Linker构建的融合酶与亲本酶酶活,发现用Linker a3、pS3和具有“自我剪切”能力T2A构建的融合酶在木聚糖酶和甘露聚糖酶活性都显著高于两亲本酶。融合酶XynB-a3-ManA的木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活比亲本酶XynB和ManA分别提高了54.06%和104.40%;该融合酶在酸性环境3.0—7.0起作用,对pH3.0~8.0具有一定的耐受力。【结论】首次获得可在哺乳动物系统表达分泌的增强型双功能XynB-ManA融合酶。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

乳糖诱导酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

[目的]以融合酸性木聚糖酶基因的大肠杆菌（E．coli）B121（DE3）为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的表达规律。[方法]以重组木聚糖酶比酶活为评价指标,利用单因素试验和k（3。）正交试验考察摇瓶发酵条件下诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对木聚糖酶表达的影响。[结果]各因素影响程度依次为：诱导时机〉诱导温度〉诱导时间〉诱导剂浓度;最优表达条件为：诱导剂浓度5∥L、诱导时机0．5h、诱导培养时间4．5h、诱导培养温度32℃;在此工艺条件下,重组木聚糖酶比酶活可达49．69U／mg。[结论]乳糖作为诱导剂能够成功诱导酸性木聚糖酶在大肠杆菌中的表达。     

来源于盐惰菌属Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在毕赤酵母中诱导表达及其酶学性质的研究

根据毕赤酵母的密码子偏爱性和木聚糖酶的蛋白序列设计并合成了木聚糖酶基因片段,与表达载体pYPX88连接,构建成分泌表达载体;构建的分泌表达载体经BglⅡ酶切后电击转化到毕赤酵母GS115中,筛选得到阳性克隆。研究了重组木聚糖酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性以及部分金属离子、十二烷基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇(DTT)对该酶性质的影响。结果表明:重组木聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4.5—8.0时酶学性质稳定;最适温度为60℃在20-65℃时酶学性质稳定;金属离子Mn~(2+)与Cu~(2+)对该酶有抑制作用,化合物DTT对该酶有明显促进作用。     

乳杆菌乳糖酶的基因异源表达及酶学性质分析

采用简并引物PCR和TAIL-PCR方法,从乳杆菌Lactobacillus sp. B164中克隆得到一个乳糖酶基因bg42-164。基因全长2 031 bp,编码676个氨基酸和一个终止密码子,预测分子量76 kDa,无信号肽序列。将bg42-164连接pET-30a(+)载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后可检测到乳糖酶活力。SDS-PAGE分析乳糖酶BG42-164的蛋白分子量为76 kDa,使用组氨酸标签亲和层析方法进行蛋白纯化,并对纯化的乳糖酶BG42-164进行了酶学性质分析。该酶最适反应温度为50℃,经50℃处理30 min后,剩余酶活力保留80%以上,pH 6.0时该酶的水解活力最高。牛奶水解试验表明,乳糖酶BG42-164对乳糖的水解效果良好,5 mL牛奶中添加250 U酶蛋白,在50℃条件下2 h乳糖水解率为100%。该酶温度范围宽,乳糖水解效果好,为其在低乳糖奶生产中应用奠定了理论基础。     

JS018菌有机磷农药降解酶的纯化

实验对一株能高效降解几种有机磷农药菌株JS018的降解酶进行分离和纯化。经分析该降解酶主要位于细胞间质,最适盐析硫酸铵饱和度为60%~70%,粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和DEAE-52柱层析得到较高纯度的酶液。通过PAGE和SDS-PAGE电泳测定该酶分子量约为37KDa,N末端16个氨基酸残基测序的结果为:GAPFQNDVPPACYRFR。     

东海原甲藻钙调蛋白的分离纯化及鉴定

以东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense Lu）为材料,经热变性、离心处理,上清液依次经DEAE纤维素阴离子交换层析和苯基．Sepharose CL．4B疏水层析分离纯化钙调蛋白（CaM）．SDS—PAGE和Westem blot检测结果显示：东海原甲藻中CaM的相对分子质量为16ku．采用该实验方法首次有效地从海洋浮游植物东海原甲藻中分离纯化出钙调蛋白．     

JSO18菌有机磷农药降解酶的纯化

实验对一株能高效降解几种有机磷农药菌株JSO18的降解酶进行分离和纯化。经分析该降解酶主要位于细胞间质，最适盐析硫酸铵饱和度为60％～70％，粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephade。G-100凝胶过滤和DEAE-52柱层析得到较高纯度的酶液。通过PAGE和SDS—PAGE电泳测定该酶分子量约为37KDa．N末端16个氨基酸残基测序的结果为：GAPFQNDVPPACYRFR。     

卷须链霉菌木聚糖酶B的纯化

为了进一步研究链霉菌木聚糖酶的酶学性质，探讨了卷须链霉菌一种木聚糖酶的纯化方法。粗酶液经硫酸铵饱和度为20％～50％的分级沉淀和Q-sephrose FF离子交换柱层析2步纯化，得到一种电泳纯的木聚糖酶。定名为XynB；酶蛋白纯化倍数达到10．0倍，酶活力回收率达到24．0％。SDS-PAGE结果表明，该木聚糖酶的分子质量为22．0ku，属于低分子质量的木聚糖酶。     

Roseomonas JS018有机磷农药降解酶的纯化

本试验对能高效降解几种有机磷农药菌株JS018的降解酶进行分离和纯化.经分析该降解酶主要位于细胞间质,最适盐析硫酸铵饱和度为60%-70%,粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和DEAE-52柱层析得到较高纯度的酶液.通过SDS-PAGE电泳测定该酶相对分子质量约为37 ku,N末端16个氨基酸残基测序结果为:GAPFQNDVPPACYRFR.     

三步层析法分离毕赤酵母工程菌中表达的新疆家蚕抗菌肽

通过离子交换层析、疏水作用层析和分子排阻层析等三步层析的方法,分离纯化了毕赤酵母工程菌所表达的新疆家蚕抗菌肽.结果表明,三步层析后,SDS电泳显示单一条带,分子量约为7.0 kDa;所纯化的新疆家蚕抗菌肽具有较强的抗菌活性.该纯化工艺的建立,为新疆家蚕抗菌肽在饲料添加剂、农用抗生素等方面的广泛应用奠定基础.     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

冬小麦中玉米赤霉烯酮结合蛋白的分离纯化

玉米赤霉烯酮是植物体内源产生的一类小分子生理活性物质，已证明它与冬性植物的春化作用密切相关。本研究应用亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对春化的冬小麦幼苗中的玉米赤霉烯酮结合蛋白进行了分离纯化。供试材料为冬小冬品种燕大1817，种子萌发后在4℃一春化4周，提取幼苗的水溶性总蛋白进行亲和层析。层析基质为琼脂糖凝胶Sepharose4B，配体为玉米赤霉烯酮多聚赖氨酸复合物。总蛋白溶液先经过Sepharose4B结合后，再与连有配体的亲和胶进行反应，然后洗去非结合蛋白；改变洗脱条件，进一步洗涤得到的为玉米赤霉烯酮结合蛋白（ZBP）溶液。研究结果表明，在春化的冬小麦幼苗中存在两种玉米赤霉烯酮结合蛋白，它们的分子量分别为25.4kD和22.9kD。     

乌贼墨中多酚氧化酶的分离及纯化

用pH7.2磷酸提取缓冲液从乌贼墨汁澡提取多酚氧化酶，提取的粗酶液经30%-80%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-SepharoseCL-6B柱层析和SephadexG-150柱层析后，得到纯化的多酚氧化酶，纯化们数为10.78，纯化后的酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别采用银染色和多酚氧化酶活性染色均显示一条电泳带。