CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

CRISPR/Cas9系统构建的水稻OsPht基因突变体材料可用于养分转运评价

【目的】CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为免受外来DNA片段侵袭形成的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas9已经被作为一种基因编辑的工具广泛应用到很多动物和植物的基因编辑。磷元素是植物生长过程中必需的营养元素,植物对磷的吸收主要由跨膜磷转运蛋白完成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对Oryza Japonica Kitaake水稻中冰叶日中花磷转运蛋白McPht基因的同源体OsPht磷转运蛋白基因进行编辑,构建了McPht转运蛋白基因导入水稻OsPht缺失的突变体,初步验证了该突变体材料的功能。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将水稻中与McPht蛋白同源性最高的磷转运蛋白基因进行编辑。首先将待编辑的基因片段连接到U3启动子驱动的pCXUN表达载体上,转化到农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌转化到水稻幼胚,将获得的转化后再生T0代株系移栽到田间获得T1代种子,并将T1代株系进行盆栽培养,提取株系叶片基因组DNA用于PCR检测,所有株系PCR产物纯化后进行测序,依据序列变化判定目标基因的编辑位点,并对突变体进行生理指标测定。【结果】1) 基因编辑后的类型可分为两类,一类为目标编辑片段20个碱基中后6个碱基缺失,另一类为目标编辑片段20个碱基中后8个碱基缺失或突变。2) 编辑位点缺失6个碱基的株系占总突变株系的28.6%,编辑位点缺失8个碱基的株系占总突变株系的42.9%,GT碱基突变株系占总突变株系的28.6%。3) 水稻突变体的株高、鲜重、根系活力均小于野生型;根系扫描结果显示水稻突变体的根长、投影面积、表面积和侧根数均大于野生型;Cas-2的叶绿素和可溶性糖含量显著高于野生型,Cas-7的叶绿素和可溶性糖含量小于野生型,但差异不显著。【结论】CRISPR/Cas9基因编辑系统成功将水稻中McPht的同源体OsPht基因进行了编辑,所获得的水稻磷转运蛋白OsPht基因碱基缺失或突变不仅为所编辑基因的功能研究提供有效的科学依据,同时为冰叶日中花McPht磷转运蛋白基因导入OsPht基因功能缺失的水稻株系、验证其生理生化功能提供宝贵的评价材料支持。本研究表明基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统在功能性评价植物养分转运蛋白基因方面是一条有效的途径。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用

CRISPR/Cas9是由小导向RNA介导的基因组定向编辑技术。自2005年以来,该技术得到飞速发展,在生物学、医学和作物遗传育种等多个学科得到广泛应用。与以往的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9技术具有独特的优越性,以其简便的操作和极高的编辑效率成为目前最主要的基因编辑技术。本文系统阐述了CRISPR/Cas9技术的起源发展、基因编辑特点,总结了该技术在作物基因编辑和其他方面的应用,旨在为利用该技术进行农作物种质创新、基因挖掘和育种提供参考。     

CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOC_Os05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究

为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。     

CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用

CRISPR/Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,其操作方便、效率高、成本低.水稻作为全球粮食安全的战略作物,优质高产的水稻培育尤为重要,CRISPR/Cas9技术为水稻分子育种带来了突破.本文回顾了基因编辑技术的发展,详细介绍了CRISPR/Cas9系统的结构、组成及原理,重点阐述了该技术在水稻分子育种中的应用,探...     

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。     

CRISPR/Cas9介导绵羊成纤维细胞MSTN基因突变系统的构建

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。     

基于CRISPR系统基因编辑与基因调控技术的发展

由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的系统被发现广泛存在于细菌及古菌中,是机体长期进化形成的由RNA指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA的双链切割,因此从2013年起,CRISPR/Cas9系统即被改造为基因编辑工具。作为一种新型的基因组编辑技术,CRISPR/Cas9系统具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命,并且迅速在基础理论、转基因动物生产、基因诊断和临床治疗等领域中得到广泛的研究与应用。然而,CRISPR/Cas9也存在着脱靶效应和外源基因插入困难等一些亟待解决的问题,这在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。因此,近年来围绕CRISPR系统改进获得了一系列可用于基因编辑与基因表达修饰的新工具。本文介绍了CRISPR系统的组成、工作原理,并综述了近几年来基于CRISPR系统开发的几种新型基因编辑工具以及基因表达修饰工具的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

本文重组和构建了新城疫病毒 ( NDV)融合蛋白基因 ,并对该基因进行了鉴定 :将新城疫病毒 F基因片段经 RT— PCR扩增 ,插入经 Eco R I/ Sal 酶切的克隆载体 p UC18及表达载体 p GEMEX,转化大肠杆菌 JM10 9株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆 ,再用双酶切法、核酸探针、 PCR及核苷酸序列分析法鉴定 ,表明插入成功并且阅读框架正确     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

PRK基因原核表达质粒的构建

以拟南芥cDNA为模板,扩增出PRK基因,构建重组质粒pET-28a(+)-PRK转化大肠杆菌DH5α。经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌表达载体BL21中,构建PRK基因原核表达载体。测序结果表明pET-28a(+)-PRK载体构建成功。     

猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白 全基因的克隆及融合表达

采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合.     

纳米磁性颗粒介导的辣椒遗传转化体系建立

为建立一套可操作性强、广谱性强、高效的基因编辑辣椒遗传转化体系,以辣椒B2为试验材料,磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和载体质粒pCas9-TPC按质量比1:1复合30 min后,加入混有辣椒花粉的培养基中,于MagnetoFACTOR plate24磁板下室温放置30 min,在磁场作用下导入花粉。将携带CRISPR/Cas9基因载体的花粉进行人工授粉,果实成熟后收获种子。通过载体质粒DNA上携带的抗除草剂(草铵膦)抗性标记,检测转化情况。提取T₀代植株的DNA和RNA及T₂代DNA,以pCas9-TPC为模板设计引物进行PCR扩增,检测T₀和T₂代植株中是否存在pCas9-TPC载体,对T₀代植株进行Southern杂交检测基因编辑载体与辣椒基因组的整合情况。结果显示,平均转化效率约为63.70%,PCR检测显示T₀代植株DNA和RNA及T₂代DNA均扩增出CRISPR/Cas9载体,随机选取8株阳性植株进行Southern杂交,随机出现1~3条条带。本研究表明纳米磁性颗粒介导的花粉转化法可以在辣椒上建立高效的基因编辑转化体系,为辣椒的遗传育种提供更好的工具。     

含绿色荧光蛋白基因与强毒部分糖蛋白B基因的马立克病毒CVI988株转移载体的构建

提取马立克病毒病毒疫苗毒株CVI988／Rispens感染的鸡（Gallus domesticus)胚成纤维细胞（CEF）的总DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒生长非必要的US2基因（约2.0kb)，将其克隆入T－easy载体获得载体pGUS2。用Eco R I和Bam H I消化pUR-MDVEgB质粒，回收1.8kb包含糖蛋白B（gB)基因主要抗原位点片段，插入pEGFP-C1质粒多克隆位点，构建了在CMV启动子和增强子控制下的含GFP及部分gB基因的表达盒。将此表达盒克隆入pGUS2载体US2基因中，成功地构建了含GFP及部分gB基因的转移质粒载体pEGFPgB。为其与CVI988毒株共转染CEF可获得表达GFP及强毒部分gB蛋白重组CVI988疫苗毒株打下基础。     

CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是新一代的基因定点编辑技术,已成功应用于多种物种,例如,人、鼠、果蝇等。简单介绍该技术在水稻中的研究进展。涉及该系统的启动子、转化方法、突变效率等内容。     

利用Cre/loxp定位重组系统构建雄性不育基因和恢复基因表达载体

结合Cre/lox定位重组系统和杂种一代的育种特点，构建了反义肌动蛋白雄性不育基因表达载体pCABARTAAct和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pSTAAct中的反义肌动蛋白雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、反向插入TA29启动子下游的Actin基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp两个同向lox位点之间，再将上述表达盒连同lox位点切下插入pcAMBar，获得以除草剂Basta为筛选剂的反义肌动蛋白雄性不育基因表达载体pcABARTAAct。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因，克隆测序验证无误后插入PBl525 CaMV35S-35S双启动子和Nos终止子之间，再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点，得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。     

TES基因C端的分段克隆与表达

为了在大肠杆菌中分段表达人类TES基因C端3个顺次排列的LIM结构域,利用PCR技术从含有TES基因全长编码序列的质粒pCMV-HA-TES中扩增出这3个LIM domain基因片段,分别重组入pGEM-T载体,再经酶切后,将获得的目的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1进行融合表达。酶切鉴定及测序结果表明,扩增产物与已知基因序列一致,成功构建了3个目的片段的pQE-N1表达质粒;SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导表达出与预期分子质量大小相同的3个融合蛋白。     

利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区

斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39％.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具.     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA.