紫娟茶树叶片不同发育期花青素积累及合成相关基因的表达

为明确紫娟茶树（Camellia sinensis cv. Zijuan）叶片发育中花青素积累特性及合成途径上相关基因的表达特点,利用液质联用法（HPLC-MS）、转录组测序（RNA-Seq）和数字基因表达谱技术（DGE）,分析了紫娟茶树芽、第二叶、开面叶和成熟叶4个发育期花青素的种类、含量及合成相关基因的表达水平。结果表明,花青素积累量随叶片发育先增加后减少,第二叶含量最大（9.87βmg·g^-1）、成熟叶含量最小（0.11βmg·g^-1）,与叶色表现相吻合。结构基因PAL在芽、第二叶和开面叶高表达,在成熟叶下调表达;C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H和ANS表达模式相似,表达量均随叶片发育而降低,在芽期高表达,在成熟叶全部下调表达;FLS在第二叶上调表达,在成熟叶下调表达,与花青素积累情况一致;DFR在各发育期均有上调和下调表达。GT和ACT表达模式相似,在第二叶、开面叶和成熟叶上调表达;ANR和LAR表达模式相似,在芽、第二叶和开面叶高表达,在成熟叶下调表达。bHLH、MYB和WDR在各发育期均有上调或下调表达。说明紫娟茶树叶片不同发育阶段结构基因和调控基因的表达水平不同,导致花青素积累存在差异,具有一定的时间表达特异性。     

利用基因芯片筛选茶树芽叶紫化相关基因

采用基因芯片技术对龙井群体中紫芽资源和绿芽资源进行分析,探索茶树紫化相关的差异表达基因。结果检测到差异表达基因43个,其中上调表达基因17个,下调表达基因26个。以基因芯片中紫芽资源上调基因TC0002e03和下调基因TL016D09、TL011D06,及不变基因TL022H08、TL024B05为材料,用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,二者完全相符。根据基因芯片的实验结果,采用数据库查询方式对43个差异表达基因进行功能注释,结果表明差异表达基因主要与能量代谢、次生代谢和转录调控等分子功能有关,特别是在差异表达基因中还包含两个与花青素代谢途径直接相关的基因,苯丙氨酸解氨酶和花青素还原酶基因,同绿芽资源相比,它们在紫色资源中分别下调3.44倍和上调2.09倍;同时还筛选到两个可能调控花青素合成的转录因子MYB蛋白和WD40蛋白,分别上调2.25倍和2.54倍。这些研究结果将为深入理解茶树芽叶的紫化机理,克隆相关基因打下基础。     

基于高通量测序筛选‘紫娟’花青素合成相关的miRNA

为筛选调控紫娟茶树花青素合成相关miRNA,以茶树品种紫娟（ZJ）、云抗10号（YK）和福鼎大白茶（FD）为材料,构建了miRNA文库。鉴定出46种已知的miRNAs和67种新的miRNAs,预测到具有注释的靶基因765个。通过差异表达分析,筛选出在ZJ与YK、ZJ与FD共有差异表达的miRNA 24个。通过对24个差异表达miRNA的靶基因分析,筛选出可能参与调控花青素合成的miRNA 4个,包括miR828a、miR845c、novel_14和novel_87,其预测的靶基因包括转录因子基因MYB4、MYB23、MYB26、MYB82、bHLH74以及4-香豆酰辅酶A链接酶（4CL）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和UDP-葡萄糖黄酮3-O-葡糖基转移酶（UFGT）等基因。利用RT-PCR分析8个差异表达的miRNA,其结果与转录组分析一致。本研究结果为进一步开展茶树花青素生物合成的调控机制研究奠定基础。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

利用NCBI茶树转录组数据库,以铁观音芽叶为材料,克隆了茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长。CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长分别为1β879βbp和1β764βbp,分别含有1β539βbp（编码513个氨基酸）和1β533βbp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示,CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%,为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明,2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示,CYP71A26与CYP71B34在分子进化树上分属两大分支,2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示,CYP71A26与CYP71B34主要由N端的β折叠和C端的α螺旋结构组成,且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明,CYP71A26与CYP71B34基因在不同茶树害虫为害的叶片中,分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下,CYP71A26与CYP71B34基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树CYP71A26与CYP71B34基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应,但两个基因表达相反,参与环节可能相反。     

玉米自交系X178、掖478授粉前后miRNA表达差异分析

基于HiSeq高通量测序技术并结合生物信息学方法对X178、掖478两种材料授粉前后两个时期穗已知miRNA及靶基因进行分析。结果发现,X178授粉前后差异表达miRNA有100个,分别属于21个miRNA家族;掖478授粉前后共筛选出98个有差异的miRNA,分别属于22个miRNA家族。利用miRNA与靶基因mRNA负调控关系初步确定授粉前后miRNA可能调控的mRNA靶点,建立miRNA-靶mRNA一一对应关系。结果表明,X178中上调表达的13个miRNA对应11个下调表达靶基因,下调表达的33个miRNA对应41个上调表达靶基因;掖478中上调表达的5个miRNA对应7个下调表达靶基因,下调表达的28个miRNA对应33个上调表达靶基因,其中,6个miRNA家族共靶向11种mRNA。研究结果表明,在授粉前后玉米穗中已知miRNA在不同玉米自交系中种类具有差异。     

茶树抗逆相关基因ERF的克隆与表达特性分析

对利用cDNA-AFLP技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF,通过RACE方法获得含完整编码区序列的茶树ERF基因cDNA克隆,其开放阅读框编码212个氨基酸,包含一个保守的结构域AP2/ERF,与多种植物ERF蛋白具有高度同源性。qRT-PCR分析表明,茶树ERF基因受低温、乙烯、脱水、NaCl等上调表达,最大表达量分别是诱导前的121.1、22.6、2.6和2.2倍。在不同组织器官中,茶树ERF基因在转录水平上存在显著差异,成熟叶片中表达最高,其次是芽,而根和茎中表达量较低且相当,花和种子中表达极低。推测该基因在茶树响应非生物胁迫中发挥重要作用以及在组织中的表达受到严格控制。     

应用基因芯片分析短日低温条件下新型粳稻光温敏核质互作不育系育性相关基因

为了解具有三系和两系两套不育机制的新型粳稻光温敏核质互作不育系2310SA分子水平上的育性机理,同时也试图对水稻雄性不育现象做进一步探讨,利用水稻基因芯片,以2310SA及其保持系两系光温敏不育系2310S为材料,在安徽合肥秋季自然短日低温条件下,比较了稳定不育的2310SA和恢复可育的2310S(对照)减数分裂期、单核期、二核期和三核期等4个穗发育时期花药基因表达谱的变化差异。减数分裂期(上调表达基因1938个,下调表达基因1635个)和三核期(上调表达基因2220个,下调表达基因2656个)差异表达基因数目多于单核期(上调表达基因752个,下调表达基因693个)和二核期(上调表达基因1025个,下调表达基因886个),三核期下调表达基因比上调表达基因多,其他3期上调表达基因比下调表达基因多。所有差异表达基因聚类显示,单核期和二核期差异表达基因聚为一类,减数分裂期和三核期差异表达基因独立成为第2类和第3类。筛选出147个在4个穗发育时期都差异表达的基因。这些共有差异表达基因也只有在三核期下调表达基因比上调表达基因多。这些共有差异表达基因,参与了生物合成、刺激反应、光合作用、信号传导、大分子的新陈代谢、运输、转录调节、碳水化合物的代谢、花的发育和细胞死亡等11类生物学过程。所得共有差异表达基因中存在与脂类代谢有关的细胞色素P450家族蛋白和β-环羟化酶,与热激反应有关的热激转录因子、热激蛋白DnaJ家族蛋白及热激蛋白70等相关基因。这些基因与细胞死亡有直接或间接的关系,它们的异常表达可能与不育花粉的形成有关。     

温湿度变化对茶苗芽萌发基因表达的影响

利用数字基因表达谱技术研究了温湿度变化对秋插茶苗芽萌发基因表达的影响。通过保温棚处理日均温度提高约5.15℃,湿度提高5.10%,两者茶苗芽萌发具有明显差异。比较保温棚与对照芽的基因表达共筛选获得949个差异表达基因,其中503个基因受保温棚处理诱导上调表达,446个基因下调表达。对差异表达基因进行GO分类分析,在P值<0.01的情况下,有360个基因与14个GO分类匹配。其中7个GO分类与光合作用相关,P值最小的GO分类为光系统,其11个基因均表现为上调表达,说明高温高湿条件具有促进光合相关基因表达的作用。这些结果将为深入研究理解茶苗的生长机制及相关基因的克隆打下基础。     

利用cDNA-AFLP技术分析炭疽菌危害诱导茶树的差异表达基因

应用cDNA-AFLP技术筛选炭疽菌（Colletotrichum sp.1）危害诱导茶树毛蟹品种（Camellia sinensis cv. Maoxie）的差异表达基因,为探究茶树抗炭疽菌的分子机制奠定基础。利用256对选择性扩增引物组合分析病菌接种后0 h和48 h的叶片cDNA,经筛选、测序和BLAST比对获得136条差异表达片段（TDFs）。同源基因功能分析结果表明,128条TDFs与Nr数据库已有基因同源,其功能以胁迫响应、生物调控与信号转导为主;其中51条TDFs与TPIA数据库中冷害、干旱、盐碱条件下的差异表达基因高度同源。进一步对27条TDFs进行qRT-PCR验证,结果显示,有24条TDFs的表达情况与cDNA-AFLP的结果一致,WRKY转录因子、乙烯响应转录因子、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗逆相关基因的表达显著上调。本试验通过筛选获得差异表达的抗逆相关基因,为后续的基因功能研究奠定基础。     

茶树cpDNA测序及基于cpDNA序列的山茶属植物亲缘关系研究

叶绿体基因组在物种鉴定、系统进化分析及亲缘关系研究等领域应用前景广阔。本文应用Illumina高通量测序技术对龙井43（Camellia sinensis cv. Longjing 43）的叶绿体全基因组进行测序;利用叶绿体trnL-trnF序列研究茶树及其近缘植物的亲缘关系。结果表明,龙井43叶绿体基因组全长为157 096 bp,反向互补重复区（Inverted repeat, IR）为26 080 bp,小单拷贝区（Small single copy region, SSC）、大单拷贝区（Large single copy region, LSC）分别为18 283 bp、86 653 bp。共注释叶绿体基因133个,其中蛋白编码基因86个,rRNA基因8个,tRNA基因39个。对所选植物的trnL-trnF序列进行比对,序列长度变异范围为481~501 bp,序列最长为岔河大茶,最短为金花茶,基于此序列构建亲缘关系树,山茶属茶组植物聚成一个组。研究结果对茶树优良品种培育及山茶属植物亲缘关系的研究具有重要价值。     

茶树腐皮镰刀菌拮抗菌株的筛选鉴定及促生防病特性分析

腐皮镰刀菌（Fusariumsolani）是可以引起茶树茎腐和枯萎的致病真菌。为获得对茶树腐皮镰刀菌有拮抗效果的生防菌株，从河南省信阳市新县茶园收集的茶树（Camelliasinensis）健康叶片中采用梯度稀释法分离纯化得到内生细菌56株，通过平板对峙法筛选对腐皮镰刀菌抑制效果较好的菌株，并根据形态特征、生理生化特征和分子生物学技术对其进行鉴定，测定其防病促生指标并进行抑菌谱试验，通过发酵液试验和平板对扣法评估挥发性物质对腐皮镰刀菌菌丝生长的影响。结果显示，筛选得到的菌株YB-1476对腐皮镰刀菌菌丝生长抑制率达到63.31%，拮抗效果最佳，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。该菌株有产铁载体和吲哚乙酸、分泌β-1,3-葡聚糖酶和纤维素酶及溶磷的能力。抑菌谱试验表明，菌株YB-1476对平脐蠕孢菌（Bipolarissorokinana）、禾谷镰刀菌（FusariumgraminearumPH-1）、念珠状镰刀菌（Fusarium moniliforme）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）和茄链格孢菌（Alterna...     

外源水杨酸诱导香蕉苯丙烷类代谢提高对枯萎病抗性

由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4, TR4）引起的香蕉枯萎病严重阻碍我国香蕉产业的绿色可持续发展。外源水杨酸（SA）处理能诱导香蕉体内SA合成及信号传导途径关键酶基因上调表达,激活香蕉植株内系统获得抗性,增强对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力,在此基础上,本研究对香蕉感病品种‘巴西蕉’和抗病品种‘农科1号’进行SA诱导处理,随后接种TR4,结果显示2个品种的病情指数均降低。为了进一步探究水杨酸信号途径下游的苯丙烷类途径在SA诱导的香蕉植株抗病过程中的作用,本研究运用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）,对SA处理的感病品种‘巴西蕉’和抗病品种‘农科1号’中苯丙烷类途径关键基因的表达情况进行分析,结果发现分支途径中常规苯丙烷类途径关键酶基因C4H和4CL、木质素合成途径关键酶基因CAD和CCoAOMT、黄酮类物质生物合成途径关键酶基因CHS和CHI,对SA处理和TR4接种均有响应。在仅接种TR4的情况下,‘巴西蕉’相关基因主要表现为显著下调表达,而‘农科1号’相关基因主要表现为上调表达;仅用SA处理时,2个品种的C4H和4CL被诱导上调表达;SA处理并接种TR4,2个品种C4H和4CL依然保持上调表达的趋势,变化幅度在‘农科1号’中偏高;‘巴西蕉’CAD经SA诱导上调表达,但在接种TR4后,CAD相对表达量降低,而‘农科1号’CAD被SA诱导显著上调表达,SA和TR4共同作用下,表达水平亦显著升高;‘巴西蕉’CCoAOMT被TR4诱导显著上调表达,在SA处理并接种TR4的‘巴西蕉’植株中也表现为上调表达,‘农科1号’CCoAOMT在SA处理或SA、TR4共同作用下表现为强烈上调表达;CHS和CHI在SA处理的2个品种中主要表现为上调表达,SA和TR4双重作用下,依然表现为上调表达。结果表明外源SA处理可诱导感病和耐病香蕉根组织中苯丙烷类途径关键酶基因上调表达,该途径在SA诱导的香蕉抗枯萎病过程中起着重要作用。     

信阳10号叶绿体基因组及其系统进化

信阳10号是适制信阳毛尖的国家级良种,然而其起源以及与其他茶树品种之间的进化关系尚不清晰。利用MGI2000平台对信阳10号进行测序,组装获得了信阳10号的完整叶绿体基因组并对其结构进行分析,同时,为探究信阳10号与其他茶树的进化关系,构建了46个物种的叶绿体基因组系统发育树。结果表明：（1）信阳10号叶绿体基因组大小为157 041 bp,包括2个反向重复区（IR,26 078 bp）,1个大单拷贝区（LSC,86 594 bp）和1个小单拷贝区（SSC,18 291 bp）;共注释得到叶绿体基因113个,包括79个蛋白质编码基因,30个tRNA基因和4个rRNA基因。（2）在信阳10号的叶绿体基因组中共检测到了74个SSR位点,大部分SSR由A/T组成。（3）贝叶斯法构建的系统进化关系树显示,信阳10号与福建铁罗汉关系最近,并且两者的叶绿体基因组完全相同,推测可能来源于相同母本;信阳10号与韩国茶Chamnok和Sangmok、福建白鸡冠、云南德宏茶也有较近的亲缘关系。研究结果为进一步探究茶树起源与演化以及分子育种提供了基础。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

Anthocyanin accumulation,biosynthesis and antioxidant capacity of black sweet corn (Zea mays L.) during kernel development over two growing seasons

In this study, the content changes of anthocyanins levels, antioxidant activities as well as related genes in their biosynthesis pathways of two seasons black sweet corn kernels were determined. Generally, three anthocyanins contents showed similar trend with peak at 10 days after pollination (DAP) in both seasons existing as free forms, and they gradually grew afterwards as kernel matured. Pelargonidin as the leading component was decreased significantly in autumn comparing to contents in summer which may be affected by lower photosynthetically active radiation (PAR) and distinct gene expression levels. CF1, F3H and LAD as the essential genes in flavonoid and anthocyanin biosynthesis had high expression levels indicating higher production of flavonoid and anthocyanin. Black sweet corn (BSC) exhibited good in vitro and cellular antioxidant abilities compared to many fruits and vegetables indicating that BSC could be developed as a substitute food with high anthocyanin profiles and antioxidant capacity.     

大叶茶(Camellia sinensis var.assamica)的命名、模式及自然分布

大叶茶（Camellia sinensis var. assamica）在全球广泛种植,是商品茶叶的重要原料来源。本文系统地回顾了大叶茶学名的合格发表及其命名模式的研究进展。依据《深圳法规》条款41.4,Griffith在1854年将茶组[Camellia sect. Thea (L.) Griff.]作为新等级名称、而非新类群名称合格发表。老挝茶因其叶背具腺点、花柱离生而被移出茶组。Masters在1844年并未合格发表Thea assamica,此名称最早由Hooker于1847年合格发表,Steenis于1949年提出的新组合Camellia sinensis (L.) Kuntze var. assamica (Hook.) Steenis应为大叶茶的完整学名。英国邱园馆藏标本W. Griffith s.n.（K000939670）在2021年被指定为大叶茶的新模式。本文同时总结了迄今归并的7个大叶茶的异模式异名的原白和模式。尽管Darlington和Ammal在1945年将大叶茶作为物种处理并提出新组合名称C. assamica,多学科证据却支持大叶茶是茶的变种。假如大叶茶的物种地位被接受,那么1838年发表的大叶茶的异模式异名C. theifera将取代C. assamica而获得物种阶元上的优先权,届时,广泛使用的种加词“assamica”或可依据《深圳法规》条款14提议作为保留名称。本文同时总结了大叶茶在中国、印度、老挝、缅甸、泰国和越南的自然分布点,并讨论了它在不同原产国的自然资源的保护和利用现状。