番木瓜镁离子转运蛋白基因CpMGT1的克隆与功能分析

镁是一种大量金属营养元素,其在植物的生长、发育、光合、胁迫响应等生物学过程中起重要作用。在高等植物中,Mg²⁺的吸收、运输、分布和再分配主要由镁离子转运蛋白（MGT/MRS2）和Mg²⁺/H⁺交换体（MHX）介导。其中,MGT/MRS2又名CorA,最先在鼠伤寒沙门氏菌中被发现,后在拟南芥、水稻等模式植物中进行了较为深入的研究。番木瓜（Carica papaya L.）是一种隶属于十字花目番木瓜科的重要热带果树,至今还未见有关MGT基因的报道。本研究基于番木瓜的基因组和转录组数据,采用RT-PCR技术成功克隆到一个MGT基因（CpMGT1）,应用生物信息学手段预测蛋白的理化特性和保守基序,运用qRT-PCR分析基因的表达模式,利用缺失CorA、MgtA和MgtB的沙门氏菌突变株MM281进行功能互补。结果表明：CpMGT1的编码区为1332 bp,预测编码443 aa,理论分子量为50.43 kDa、等电点为5.12;该蛋白含有2个疏水跨膜区（TM1和TM2）,其中TM1包含高度保守的GMN基序;进化及亚细胞定位分析表明CpMGT1与拟南芥中AtMGT1和AtMGT2的亲缘关系较近,定位于细胞膜;定量分析显示CpMGT1基因为组成型表达,其中在根、茎和果实中的表达量较高;在MM281中异源表达可显著提高工程菌在低Mg²⁺浓度下的生长速率,表明CpMGT1具有高效的Mg²⁺转运活性。CpMGT1的克隆与鉴定为进一步揭示番木瓜MGT基因在不同组织特别是在果实中Mg²⁺的积累机制奠定了坚实的基础。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

茶树CsSnRK2.1、CsSnRK2.2基因的克隆及在非生物胁迫中的响应

蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRK）是一类广泛存在于植物体内的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,其中SnRK2家族在植物非生物胁迫响应过程中起着十分重要的作用。为了探究茶树SnRK2家族基因响应逆境的分子机制,本研究克隆了两个茶树SnRK2家族基因,并分别命名为CsSnRK2.1（GenBank登录号：MG026837）和CsSnRK2.2（GenBank登录号：MF662805）,生物信息学分析表明CsSnRK2.1和CsSnRK2.2分别编码358个和337个氨基酸,与拟南芥和玉米SnRK2蛋白激酶的同源性很高,均具有保守的ATP结合位点和Ser/Thr激酶活性结构域。在高盐、干旱和ABA胁迫下,CsSnRK2.1均能被诱导表达,且呈现先升后降趋势,而在低温和高温胁迫下表达量变化不大;CsSnRK2.2能强烈响应高盐胁迫,也能被高温诱导上调表达;表明它们可能与茶树抗逆密切相关。     

茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。     

茶树CsPHT1;3基因特性及其对硒的响应研究

茶树具有较强的富硒能力，有关磷酸盐转运体参与硒吸收的分子机理研究较少。克隆茶树CsPHT1;3基因，并探究该基因的特性及对硒浓度和价态、pH、时间的响应，以及在不同聚硒茶树品系中的表达情况。基因特性分析表明，CsPHT1;3属于磷酸盐转运蛋白PHT1亚家族成员，定位于质膜且具有PHT1蛋白保守结构域GGDYPLSATIxSE。在不同器官中表达模式分析表明，CsPHT1;3在成熟叶和根中表达量显著高于其他器官。不同浓度和价态硒诱导结果表明，CsPHT1;3在茶树根系中于1 d和7 d显著受低浓度Se⁴⁺诱导表达；除处理后3 d外，茶树根系中CsPHT1;3显著受Se⁶⁺诱导上调表达且基本不受Se⁶⁺浓度影响。不同pH处理茶树结果表明，茶树根系中CsPHT1;3在pH=5时对Se⁴⁺响应于24 h达最高；在pH=3时对Se⁴⁺响应于48 h达最高；而在pH=7时，对Se⁴⁺响应于72 h达最高。硒酸钠处理不同聚硒茶树品系结果表明，CsPHT1;3在不同品系的叶...     

不同氮素形态、pH对茶树元素吸收及有机酸含量影响

以茶树龙井43为材料,利用营养液水培试验研究了不同氮素形态、pH对茶树体内阴阳离子和有机酸的影响,初步明确茶树养分吸收与氮素形态及pH的关系。结果表明,与NO_3^--N处理相比,NH_4^+-N处理提高-的含量以及根中N、SO_4^2-含量,但是NH_4^+-N处理降低了茶树对Ca、Mg、B、Mn、Zn的吸收,也减少了成熟叶中SO_4^2-、根中H_2PO_4^-的累积量。与其他处理相比,NO_3^--N处理提高了成熟叶中苹果酸、草酸、柠檬酸浓度。茶树对养分的吸收、积累也与介质pH有关,尤其是pH与氮素互作时。在NO_3^--N处理下,pH 6.0显著提高了茶树对B、Mn、Zn的吸收和根中K、Ca、Mg浓度。茶树中有机酸含量受pH影响较大,与pH 4.0和pH 5.0相比,pH 6.0提高了茶树成熟叶中苹果酸、柠檬酸、草酸浓度以及根中草酸浓度。茶树对养分的吸收、积累与自身体内有机酸浓度有较好的相关性,茶树中全氮含量与柠檬酸、草酸浓度具有显著负相关性,而阳离子Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺含量与柠檬酸、草酸浓度具有显著正相关性。     

茶树中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（CsG6PDHs）的克隆与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH,EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途径中的关键限速酶,在植物逆境胁迫响应和生长发育中具有重要作用。然而,目前有关G6PDH在茶树中的研究尚处空白。在茶树中克隆到3个CsG6PDHs基因,分别命名为CsG6PDH1（MW025829）、CsG6PDH2（MW025830）、CsG6PDH4（MW025831）。聚合进化树结果显示,CsG6PDH1和CsG6PDH4均为质体型蛋白,而CsG6PDH2为胞质型蛋白。表达分析发现,CsG6PDHs在不同组织中均有表达;低温或炭疽菌侵染条件下,CsG6PDH1和CsG6PDH4均被抑制表达;冷驯化期间,CsG6PDH2和CsG6PDH4在不同品种中均上调表达;此外,CsG6PDHs在茶芽休眠和萌发过程中均不同程度上调表达。以上结果表明,CsG6PDHs在茶树生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用,这为后续深入研究G6PDH在茶树中的功能奠定了理论基础。     

香叶醇生物合成相关基因NUDX1的进化分析

茶树中存在2个亚细胞定位不同的NUDX1基因（CsNUDX1-cyto和CsNUDX1-chlo）,其中定位于细胞质的CsNUDX1-cyto基因与香叶醇生物合成密切相关。为探究NUDX1基因在不同茶树品种中的序列、功能差异及其在物种间的进化,通过序列比对、基因克隆、进化树构建、代谢物分析、功能验证等分析了该基因在茶树与非茶树植物中的进化以及香叶醇积累差异。结果表明,不同茶树基因库中组装的CsNUDX1s核苷酸序列存在差异;RT-PCR克隆显示4个阿萨姆变种和4个中国变种茶树中均有CsNUDX1-cyto和CsNUDX1-chlo的阳性克隆,且核苷酸序列存在差异。利用Phytozome网站数据进行序列比对及进化树构建,结果显示共有58个植物中存在CsNUDX1同源基因;该基因在植物物种间较为保守,在低等植物藻类基因组中也存在;在单子叶禾本科植物中,除短柄草（Brachypodium distachyon）泛基因组中存在蛋白序列匹配率大于58%的目的基因,其余均较低,尤其是在部分禾本科植物中该基因存在缺失。代谢物分析表明15个禾本科植物水稻、小麦和玉米品种鲜叶中均未检测到香叶醇的合成,而4个茶树品种嫩梢中香叶醇含量为0.87~4.12 μg·g^-1。此外,茶树CsNUDX1s基因在幼嫩叶片中有高表达;阿萨姆变种茶树佛香3号的CsNUDX1-cyto同样具有合成香叶醇的功能。本研究表明,NUDX1基因广泛存在植物基因组中,在茶树基因组中存在2个CsNUDX1s基因,并与茶树叶片中香叶醇的合成相关。     

巴西橡胶树镁离子转运蛋白基因HbMGT10的克隆及表达分析

Mg~(2+)是植物细胞中含量最高的二价阳离子,是多种酶活性调控的辅因子,在植物的生长发育过程中发挥重要作用;同时,作为叶绿素分子的中心原子,在植物光合作用中起着至关重要的作用,但目前有关高大乔木叶片中Mg~(2+)跨膜运输的研究还很少。MGT/MRS2类型的镁离子转运蛋白在植物镁离子的跨膜运输过程中起着重要的作用,本文克隆研究了一个巴西橡胶树MGT基因,HbMGT10。亚细胞定位显示,HbMGT10定位于叶绿体膜上;酵母互补实验表明,HbMGT10具有镁离子转运功能;qRT-PCR分析结果显示,HbMGT10主要在橡胶树叶片中表达,且是叶片中表达丰度最高的HbMGT基因;HbMGT10在叶片中的表达存在明显的发育调控,随叶片发育进程表达量明显增加,在淡绿期和稳定期表达量最大;HbMGT10在成熟叶片中的表达呈现明显的日变化,在光强度最大的12:00~16:00的表达量最大。由此推测,HbMGT10在橡胶树叶片叶绿体膜的镁离子跨膜转运过程中起着重要的作用,参与了橡胶树叶片叶绿体的发育,以及叶绿体中镁离子浓度的调控,以适应橡胶树叶片的光合作用。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

茶树单宁酶CsTA的理化性质及其在绿茶饮料中的应用

茶叶中的酯型儿茶素对于绿茶滋味有着重要的影响,但是夏秋季节茶树中积累过多的酯型儿茶素会降低茶叶感官品质。前期发现的茶树单宁酶CsTA具有水解酯型儿茶素的功能,但其理化性质以及能否在绿茶饮料加工中发挥一定作用尚不清楚。在前期试验结果的基础上利用液相色谱技术对CsTA进行进一步探究。结果表明,单宁酶CsTA的最适反应温度为45℃、热稳定范围在60℃以下、最适反应pH为7.0,Mg²⁺对单宁酶CsTA活性有明显的激活作用,Cu²⁺可使其完全失活,Mn²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Li⁺对单宁酶CsTA活性具有一定抑制作用,CsTA在冷冻干燥后有很好的贮存稳定性。将茶树单宁酶CsTA应用于绿茶茶汤后发现,当茶树单宁酶CsTA添加量为11μg、料液比为1∶100、作用时间20 min、温度为35℃时对绿茶茶汤中酯型儿茶素的降解效果最好。本研究为今后利用CsTA在绿茶饮料生产中降低苦涩味,提升品质提供理论参考...     

茶树CsCHLI基因的克隆及其在不同叶色白化茶树中的表达分析

镁离子螯合酶是叶绿素合成过程中的关键酶之一,与植物叶色的白化现象密切相关.以陕茶1号、白叶1号、极白1号、黄金芽和黄金叶等5个茶树品种叶片为试验材料,分别克隆其镁离子螯合酶I亚基(Mg-chelatase I subunit,CHLI)编码基因CsCHLI全长CDS序列.多序列比对显示,白叶1号中两个碱基差异位点(G5...     

钙离子对不同发酵程度茶汤沉淀形成的影响

用含钙离子水冲泡速溶茶粉,研究了不同浓度钙离子对绿茶茶汤沉淀形成的影响,以及钙离子对不同发酵程度茶类茶汤沉淀形成的影响。结果表明,随着钙离子质量浓度（5~40 mg·L^-1）的增加,绿茶茶汤的沉淀量呈逐渐增加趋势,钙离子质量浓度与绿茶沉淀量之间具有显著正相关（r=0.98,P<0.01）,而沉淀中的茶多酚（r=0.95,P<0.01）、总糖（r=0.99,P<0.01）和咖啡碱（r=0.82,P<0.05）含量也与沉淀量呈显著正相关。相同钙离子浓度下,绿茶、铁观音、武夷岩茶、红茶、普洱茶茶汤沉淀形成量差异较大。随着茶叶发酵程度的加重,茶汤沉淀量呈增加的趋势,而钙离子对茶汤沉淀形成的促进作用逐步降低。通过分析发现,钙离子促进沉淀形成的增长率与茶汤中茶多酚所占的比率有显著相关性（r=0.78,P<0.05）,说明钙离子可能是主要通过影响茶多酚的络合作用来促进茶汤沉淀的形成。     

茶树乙醇脱氢酶基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)作为植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用。从茶树染色体级别的基因组数据库中鉴定到19个CsADH基因家族成员。系统进化树显示,茶树的ADH基因家族成员分成6个亚家族;共线性分析发现,茶树和拟南芥、葡萄与猕猴桃的ADH基因家族之间分别存在2、4、12对共线性关系;茶树ADH基因家族含有1～13个外显子,编码其氨基酸的数目为236～669,分子量为26.15～73.83 kDa,且主要定位于细胞质和叶绿体,仅CsADH1定位于细胞核。此外,对上游启动子区域分析发现了大量与光响应、植物生长发育、胁迫和激素响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量检测发现,CsFDH2在萎凋4 h时表达量最高;CsADH4和CsADH10在萎凋32 h时表达量最高,分别是对照的4.11倍和3.54倍;CsADH3在萎凋48 h时达到峰值,略高于萎凋32 h的表达量;CsADH-like1在萎凋40 h时表达量达到最高值;CsADH-like3在萎凋24 h时表达量最高。以上结果为探究萎凋过程中乙醇脱氢酶基因对...     

茶树LOX基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

脂肪族类化合物是植物芳香物质的重要组成部分,对白茶香气的形成具有重要作用.利用生物信息学方法,在染色体级别的茶树基因组数据库中,对LOX基因家族进行鉴定,从中获得12个茶树LOX基因家族成员,命名为CsLOX1～CsLOX12.12个茶树LOX基因序列,主要定位于细胞质或叶绿体中,其编码蛋白具有相同的特征结构域及保守基...     

茶树SRO基因家族的鉴定及表达分析

SROs(Similar to rcd one)是植物特有的基因家族。本研究利用生物信息学方法从茶树基因组中鉴定获得9个茶树SRO基因家族成员,分别命名为CsRCD1-4和CsSRO1-5。9个茶树SRO基因的编码蛋白均具有特征结构域PARP和RST,具有相似的保守基序。系统进化树分析聚分为3组,Ι组包含CsRCD1-4,Ⅱ组包含CsSRO1和CsSRO2,Ⅲ组包含CsSRO3-5。基因结构分析表明每个CsSRO基因含有4至9个外显子。8个茶树组织转录组数据分析表明,CsRCD1、CsRCD3和CsRCD4可能在茶树不同发育阶段具有重要作用;大多数CsSRO基因在根和成熟叶中较高表达。上游启动子区域分析发现大量与植物发育、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件,进一步对CsSRO基因在干旱和脱落酸处理下的表达模式进行分析发现,9个CsSRO基因均被诱导表达,CsSRO基因可能与茶树抗旱密切相关。