水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

豆科植物内生固氮菌的分离与筛选

以阿须贝无氮培养基为选择分离条件,对豆科植物内生细菌进行初步分离筛选,并通过固氮酶活性测定方法测定所得菌株的固氮酶活性,筛选有较高固氮酶活性的菌株.获得52株内生固氮菌,均具有固氮酶活性,其中2株固氮酶活性较高,具有潜在的应用价值.     

玉米内生固氮菌的分离鉴定及对小麦幼苗的促生效应

应用研磨法从健康玉米植株的根茎叶中分离到4株具有高固氮酶活性的内生菌,根据它们在植物组织来源和分离时稀释度的不同将其分别命名为L1A1、L1A4、L1B9和L2A2(L代表来源于叶片,A代表10倍稀释,B代表100倍稀释).经形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析,对4株菌鉴定结果表明,L1A1为约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、L1A4为Sphingomonas panni、L1B9为Sphingomonas yabuuchiae、L2A2为巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri).这4株菌均具有不同程度的固氮酶活性和产IAA(吲哚乙酸)能力,其中L1A1、L2A2具有降解有机磷能力,L1A4具有体外拮抗小麦赤霉病菌的能力.接种这4株菌的小麦苗高、根长、鲜质量、干质量和叶绿素含量均比未接菌小麦高(P＜0.05),说明其具有促进小麦幼苗生长的作用.     

植物内生固氮菌的研究进展

植物内生固氮菌是指定殖于植物体内与宿主植物进行联合固氮的一类微生物,不但具有固氮作用,还有生物防治、促进植物生长的作用。对植物内生固氮菌的研究始于上个世纪80年代,至今已从甘蔗、水稻等多种作物中分离到多种内生固氮菌。综述了10多年来内生固氮菌的研究进展,对固氮醋酸杆菌(Acetobaterdiazotrophicus)等几种内生固氮菌的生理、生物学特性及其侵染方式、传播途径和固氮机理进行了较全面的概述,并对应用内生固氮菌的可能性和意义,以及需要注意的问题作了一些探讨。     

糖蜜草内生固氮菌IS-PCR和16S rRNA基因全序列分析

采用插入序列指纹图谱分析（IS-PCR）和16SrRNA基因全序列分析,对来源于优良牧草——糖蜜草Melinis minutiflora Beauv．内生固氮菌进行研究．结果表明,糖蜜草中分离的内生固氮菌与产脂固氮螺菌模式菌株DSM1691的插入序列指纹图谱存在着差异;来源于糖蜜草的4株菌紧密地聚在一起,与GenBank中已知产脂固氮螺菌Azospirillum lipoferum的16SrRNA基因全序列有97％的序列相似性．初步确定糖蜜草中分离的内生固氮菌为一新类群的内生固氮菌．     

根际联合固氮菌对小麦生产的效应研究

在盆栽条件下,施用专性小麦根际联合固氮菌,提高了根际土固氮酶活性,植株叶绿素和全氮含量以及小玫生物产量,增加了小麦根际土和根表皮层中联合固氮菌数量;净固氮量比下不施菌增加４５－６０ｋｇ／ｈｍ＾２,与固氮效力较高的巴西固氮螺菌相当,但适应性较优。     

玉米内生联合固氮菌的分离与鉴定

试验对玉米内生固氮菌进行分离、鉴定,并研究内生细菌与玉米的联合固氮活性。结果表明,从玉米中分离出5株具有联合固氮活性的菌株,分别为1株弯曲假单胞菌NFR19(Pseudomonas geniculata),2株产酸克雷伯氏菌NFL28与NFSt18(Klebsiella oxytoca),1株节杆菌NFR7(Arthrobacter sp.),1株纤维化纤维菌NFR10(Cellulosimicrobium cellulans)。研究首次分离出具有固氮活性的纤维化纤维菌,并证实节杆菌具有固氮活性。从环境中筛选新的玉米内生固氮菌资源,促进玉米生长,为玉米内生联合固氮细菌的应用奠定基础。     

巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性与固氮能力

为了研究巨菌草内生固氮菌(Klebsiella variicola)GN02的毒理性与固氮能力,通过小鼠经口毒性和大鼠经皮毒性试验,并以克雷伯菌(K.pneumoniae)特异性引物对GN02菌株进行血清型分型。结果表明,GN02菌株无明显的经口毒性和经皮毒性,不是临床上流行肺炎克雷伯氏菌已有分型的强毒力菌株;GN02菌株在不同生长时期巨菌草根茎叶中均具有一定的固氮能力,其在各成熟期固氮率可达15%～27.27%,与其他禾本科植物所报道的固氮菌固氮效率基本相当。总之,GN02菌株安全、无毒,具有一定的固氮能力,可在农业生产中使用。     

玉米联合固氮菌的固氮活性及联合固氮效果

盆栽实验表明,分属于固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、克雷伯氏属(Klebsiella)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的9株玉米联合固氮菌均能在玉米苗根际繁殖并有固氮作用,且能提高植株的含氮量和干重。但不同菌株的固氮活性和玉米的联合固氮效果不同。     

高效固氮菌株W12对环境因子的适应性研究

从多个固氮菌株中筛选到一株固氮酶活性较高的菌株W12,为明确该菌株对不同环境因子的适应性,本文测定了不同的生长环境条件下该菌株的生长量和固氮酶活性.结果表明,在15～40 ℃的温度范围内、pH 4～8.5酸性至碱性环境和1.5% NaCl的高渗透压下,该菌株均能旺盛生长并表现很高的固氮活性;该菌株能利用多种碳源生长并固氮,还能耐受环境中存在的一定浓度的铵.说明该菌株对环境因子具有较广的适应性,并具有较强的生长活力和较高的固氮酶活性,故可望作为接种剂的功能菌株.     

内生固氮菌在水稻上的应用效果研究初报

采用盆栽和田间小区试验,探讨了水稻接种2种内生固氮菌对其生长发育的影响,结果表明:水稻接种内生固氮菌后表现出固氮特性,促进了水稻的分蘖,提高了水稻产量,且Whr50菌株的总体效果要优于Hwo52菌株;与常规栽培处理相比,水稻接种内生固氮菌后根系活力较强,特别是表现在对根系吸收活跃表面积的影响上;而在水稻生长后期,2种固氮菌的固氮能力增强,造成水稻植株出现明显贪青现象.     

玉米内生固氮菌的分离鉴定及其促生长作用研究

从玉米东单90和郑单958健康鲜植株中分离纯化内生细菌,利用乙炔还原法测定分离物的固氮酶活性,得到2株固氮酶活性较高的菌株SD1A和SD2A,分别为3284.3C2H4·h-1·mL-1和3206.8nmo1C2H4·h-1mL-1;将SD1A和SD2A的纯培养物对植物分别进行土培和水培回接试验,结果均能从植物体内重新分离到出发菌株,表明SD1A和SD2A为内生固氮菌;通过对菌株理化特性试验,结果证明二者均为克雷伯氏菌属(Klebsiella trevisan).用SD1A和SD2A处理的植株在水培试验中,株高分别为35.95cm 和35.32cm,地上部干重分别为0.106g和0.101g,与对照植株相比(株高30.38cm、地上部干重0.085g)达差异显著水平;土培试验中株高分别为68.18cm和68.58cm,地上部干重分别为1.06g和1.09g,根干重分别为0.160g和0.185g,与对照植株相比(株高62.00cm、地上部干重0.64g、根干重0.085g)均达差异显著水平,表明SD1A和SD2A对幼苗期玉米具有显著的促生长作用.     

氧对内生固氮茵的调控及其防护机理

联合固氮菌在植物固氮中发挥了重要的作用,但由于受到多种环境因素的限制,固氮效率一般都较低,因此联合固氮菌对植物的主要贡献不是提供氮化合物,而是分泌植物激素,促进宿主的生长.     

蚕豆幼苗内生固氮菌促生长特性的研究

为研究蚕豆内生固氮菌的促生长特性,对蚕豆幼苗叶和根中的内生固氮菌进行分离纯化,并测定这些菌的溶磷溶钾能力与产固氮酶、纤维素酶和果胶酶等酶的能力,确定潜在的促植物生长菌株。从蚕豆幼苗的叶和根中分离得到了8株内生固氮菌,其中7株有溶无机磷能力,2株有溶钾能力,4株有产纤维素酶能力,2株有产果胶酶能力;叶中SL24-3菌株的固氮酶活最高,还有纤维素酶和果胶酶的分泌能力,根中SR23-1固氮菌有溶解无机磷和溶解钾的能力。这些结果表明,蚕豆幼苗内生固氮菌的促生长特性明显,其中SL24-3和SR23-1固氮菌是潜在的优势促生长菌。挖掘了潜在的优良促生菌,为内生菌促进植物生长的深入研究提供理论依据,具有实际价值和意义。     

内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应

试验以从表面灭菌的稗草中分离到的一株内生固氮菌HAUM10为对象,研究发现该菌具有较强的产固氮酶和吲哚乙酸能力.乙炔还原法测定其所产固氮酶的活性为0.824 μmol C2H4/(mL·h),液相色谱法测定其产吲哚乙酸量为15.44 μg/mL.将HAUM10用gfp基因标记后接种水稻,观察其在水稻中的侵染定殖规律,发现在接种后第7天,gfp标记的HAUM10主要定殖于根内通气组织和韧皮部细胞,少量定殖在叶鞘中.盆栽试验表明,HAUM10促进水稻叶绿素合成,有利于光合作用,在水稻生长后期促进氮、磷元素由叶向穗转移.     

水稻内生固氮菌分离鉴定、生物特性及其对稻苗镉吸收的影响

【目的】分离鉴定湖南水稻内生固氮菌,研究水稻内生固氮菌的系统发育,分析测定分离菌株的生物学特性,探讨接种水稻内生固氮菌对稻苗镉(Cd)吸收的影响。【方法】表面灭菌水稻植株样品后采用低氮培养法分离水稻内生细菌,采用PCR扩增、测序检测菌株nif H基因确认分离物是固氮菌,通过16S r RNA基因序列测定、比对初步鉴定菌株,分析菌株系统发育,通过温室盆栽试验探讨接种水稻内生固氮菌对稻苗Cd吸收的影响。【结果】从8个湖南水稻植株样品中分离到19株内生固氮菌,这些菌株在系统发育地位上属于Bacillus aryabhattai、B.cereus、B.idriensis、B.indicus、B.licheniformis、B.megaterium、B.methylotrophicus、B.subtilis、B.tequilensis、Brevibacterium halotolerans、Fictibacillus phosphorivorans、Paenibacillus barcinonensis、P.lautus 4属13种。分离到的19株内生固氮菌中有大约1/3的菌株产生蛋白酶和纤维素酶的能力较强,在48℃生长良好,在产孢液体培养基上生长良好(OD1.0),在固体产孢培养基上产孢率高(60%—90%),产碱能力也相对较强(p H 8.5—9.0)。有1/6的内生固氮菌(3个菌株)分别对立枯丝核菌、禾谷镰孢、拟枝孢镰孢具有拮抗性,抑菌率为42%—55%。有大约2/3的菌株对抗生素相对比较敏感,对杀菌剂耐性强。测定的4个代表菌株对检测过的78种碳源中的7种利用较好,它们是乳酸钠、蔗糖、葡萄糖、甘油、苹果酸、丙氨酸、葡萄糖醛酰胺。试验的19株内生固氮菌中有6个菌株促进水稻苗期Cd吸收,与对照相比植株Cd含量增加6.41%—38.45%;其他13个菌株抑制水稻苗期Cd吸收,与对照相比植株Cd含量减少2.06%—34.46%。【结论】从湖南水稻分离到19株内生固氮菌,系统发育地位属于Bacillus、Brevibacterium、Fictibacillus、Paenibacillus 4属13种。部分菌株产碱能力强,产孢率高,可在48℃高温下生长,产蛋白酶、纤维素酶,拮抗立枯丝核菌、禾谷镰孢、拟枝孢镰孢,具有良好应用前景。接种水稻内生固氮菌可以显著影响水稻苗期Cd吸收,提示采用微生物方法阻控稻田Cd污染是一个非常值得研究、探讨的途径。     

不同自生固氮菌对大豆促生作用的研究

[目的]为研究接种不同自生固氮菌对大豆生长的影响。[方法]以大豆田土壤为培养基质,将9株自生固氮菌混菌接种到大豆盆栽土壤中,通过对干湿质量、叶片大小、株高、根长、须根数等指标的测定与分析,获得各菌株对大豆苗期生长的促生作用。[结果]9株菌均能促使大豆苗生长。不同菌株促生效果差异较大。其中,固氮菌2121、2212、2222和2312对大豆幼苗促生影响最为显著,菌株2122、10321、10322对大豆生长的促进效果则较差。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

具有拮抗作用的水稻内生固氮菌的分离与鉴定

从采自云南禄丰县水稻品种楚粳27的根、茎、叶中分离内生固氮菌,并测定其抑菌作用。用YMA无氮培养基分离获得125株具有潜在固氮作用的内生细菌,对125株内生细菌进行固氮酶基因nifH PCR检测,共有15株内生细菌扩增出固氮酶基因nifH片段,确定其为内生固氮菌。水稻各部位的内生细菌菌群密度不同,依次为:根>叶>茎。通过对水稻白叶枯病、条斑病、稻瘟病、纹枯病和恶苗病等5种主要病害的抑菌试验,筛选出对5种病原菌都有抑制作用的内生细菌11株;其中同时具有固氮和抑菌作用的有3个菌株,分别为NR-18、NR-64和NR-79。经16SrDNA序列测定表明,NR-18和NR-79为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),NR-64为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),均来自水稻根部。