山羊关节炎-脑炎病毒3＇LTR的克隆与序列分析

本实验通过对CAEV3’LTR克隆、测序及序列分析，对CAEV3’LTR的变异性与生物学功能有了一定的认识，为进一步揭示LTR与病毒的毒力及复制密切相关奠定了基础。     

山羊病毒性关节炎-脑炎的诊断与防治

山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)为山羊关节炎-脑炎病的病原。山羊关节炎-脑炎病是山羊感染CAEV后发生的一种慢性的消耗性的传染性疾病。CAEV可感染各个年龄段的山羊,羔羊感染后一般因为脑脊髓发生炎症而引发行为麻痹,成年山羊感染CAEV后会出现慢性的关节炎症和肺炎及乳房炎。本文对山羊关节炎-脑炎病的病原,流行病学,临床症状,病理变化,防控措施进行了阐述,望对相关工作者带来帮助,降低此病的发生,促进山羊养殖业的健康发展。     

马传染性贫血病毒LTR在驴胎皮肤细胞中的基因进化及启动子活性比较

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎皮肤细胞毒株LTR的U3负调节区出现大段的插入、点突变、缺失,U3增强子区变异较小。将LTR片段插入到pCAT-basic载体CAT报告基因前,转染驴胎皮肤细胞,通过检测CAT表达量来评价LTR的启动子活性。驴胎皮肤细胞毒株LTR的启动子活性随着病毒传代次数的增加而逐渐增强,而驴白细胞弱毒株LTR的启动子活性很低。     

酶联免疫吸附试验检测山羊关节炎脑炎病毒抗体的评价

当前,诊断山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)感染的方法包括用琼脂免疫扩散(AGID)试验及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CAEV抗体。ELISA由于简便易行,成本低并适于大批量操作而更受人们欢     

K亚群禽白血病病毒5′LTR序列及启动活性分析

通过对ALV-K 5′LTR序列及其启动活性比较分析,以探究5′LTR对ALV-K体外复制能力的影响。选取广东某黄羽祖代种鸡场健康鸡群中分离到的ALV-K(GDFX0601)毒株作为研究对象,将其5′LTR核苷酸序列与国内外不同亚群ALV分离株比较分析,并将该ALV-K接种DF-1细胞,采用ELISA对细胞培养上清进行ALV p27抗原检测以分析其在DF-1细胞上的复制能力,还分别将ALV-K(GDFX0601)、ALV-J(CHN06)、ALV-E(ev-1)和ALV-K(JS11C1)5′LTR克隆进pGL3-Basic载体,分别转染DF-1、CEF和293T细胞后测定荧光素酶活性来评估不同毒株5′LTR的启动活性。结果显示,ALV-K(GDFX0601)与其他内源性ALV LTR相似性为98.5%,而与其他外源性ALV的相似性仅有70%左右,且其LTR U3区转录调节元件与外源性病毒差异较大,与内源性病毒相似。ALV-K(GDFX0601)在ALV易感细胞DF-1上的复制速度与感染能力均弱于外源性病毒ALV-A、ALV-B和ALV-J。5′LTR的启动活性试验发现ALV-K(GDFX0601)毒株LTR的启动活性比ALV-J和LTR为外源性的ALV-K(JS11CI)毒株的启动活性弱(P0.05)。ALV-K比其他亚群ALV复制能力低可能与5′LTR启动活性有关。     

山羊关节炎-脑炎病毒甘肃株env基因的克隆和序列分析

本试验参考GenBank上发表的CAEV-63株的env基因核苷酸序列设计一对引物，以CAEV甘肃株前病毒DNA为模板，PCR扩增产物约2．9kb，与预期的目的片段大小一致。回收目的基因片段并将其克隆到pMD18-T载体上，经PCR及酶切鉴定阳性的重组质粒测序，结果表明所扩增2893个核苷酸片段含有CAEV囊膜基因的全序列，编码964个氨基酸。核苷酸和氨基酸序列分析显示，CAEV甘肃株env基因与CAEV-63美国株的env基固核苷酸和氨基酸的同源性分别为99．0％和98．1％。     

用聚合酶链反应检测山羊关节炎——脑炎及梅迪—维斯纳病毒

以CAEV的POL及MVV的GAG基因为模板，用聚合酶链反应（PCR）检测国内外不同毒株的细胞感染物。以POL为模板的PCR可检出所有CAE及MV病毒。以GAG为靶基因的PCR便检出一株MV病毒，但所有CAEV均呈阳性反应。同属侵病毒科的马传染性贫血病毒（EIAV）对两级引物的PCR均呈阴性反应。     

Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响

将来源于马传染性贫血病毒（EIAV）强毒株第25代和第118代病毒的LTR，白细胞弱毒（EIAV-DLA）的LTR，以及TAR起始碱基和／或poly（A）附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒（EIAV—FDD）的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中，获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT—FD、pCAT—G219A、pCAT—A294C和pCAT—G219A—A294C。同时用pcDNA3．1（＋）构建了EIAV反式激活蛋白（Tat）基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞，考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明，在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性，而对白细胞源的LTR无明显增强作用；TAR起始位点和poly（A）的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。     

K亚群禽白血病病毒分离株全基因组测序及序列分析

K亚群禽白血病病毒(ALV-K)是近年来从地方品种鸡分离鉴定的新亚群ALV。本试验在对江苏某原种鸡场保存的琅琊鸡开展禽白血病净化过程中,分离并鉴定1株ALV-K,命名为JS13LY19。为探明其基因组来源及特征,对JS13LY19分离株前病毒DNA进行了分段克隆和测序,获得全长基因组序列,并与各亚群ALV参考株进行比对分析。结果显示,JS13LY19分离株符合复制完整型C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因。其gp85基因相较于其他亚群ALV,与ALV-K参考株遗传进化关系最为接近,与ALV-K原型株JS11C1一致性最高(99.2%);而gag、pol、gp37、LTR、UTR及JS13LY19与内源性ALV显示出更高的一致性(92.0%～99.4%);其LTR U3区比大部分外源性ALV LTR少了1个CAAT enhancer盒、PRE盒、CArG盒及Y盒。JS13LY19分离株极有可能是JS11C1与内源性ALV重组产生,且具有内源性ALV LTR及U3区转录调控元件的部分缺失,可能使JS13LY19转录能力下降而致病性降低。     

猪内源性逆转录病毒(PERV)γ1长末端重复序列(LTRs)的分子特性及鉴定

猪基因组中的猪内源性逆转录病毒(PERV)γ1可能是异种移植(从猪到人)中的有害因子。众所周知,长末端重复序列(LTRs)是强启动元件,能够控制PERV元件和邻近功能基因片段的转录活性。本试验通过生物信息学和试验分析对猪组织中PERVγ1 LTRs的转录活性进行了研究。经RT-PCR扩增及测序鉴定出69个不同的LTR转录元件。并根据种内变异将69个LTR元件分为6个类型(15个亚型),包括串联重复序列,插入和缺失(INDEL)。更值得注意的是,所有的种内变异都发生在LTR元件的U3区域。本试验结果表明,不同PERV LTR转录体的分子特性及鉴定为进一步研究PERV及其转录奠定了基础。     

不同亚群禽白血病病毒5'LTR序列及启动子活性分析

对不同亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV) 5'LTR序列及其启动子活性进行了比较分析,以探讨LTR对ALV复制和致病力的影响。通过PCR分别扩增克隆了中国分离株GD08(ALV-A)、CD08(ALV-B)、HN06(血管瘤病变型ALV-J)和NX0101(骨髓瘤病变型ALV-J)毒株基因组5'LTR片段。与国内外不同亚群ALV分离株5'LTR核苷酸序列比较发现,NX0101株和HN06株与ALV-J国内外分离株的同源性最高,达90.8％~97.5％;GD08株与ALV-A国内分离株SDAU09C1的同源性最高,为94.6％;CD08株与GD08株和ALV-J各株的同源性高达90％以上。LTR中的R区具有较高的保守性,但CD08株U3区缺失11 bp,GD08株U5区与其它毒株的U5区差异较大。将LTR片段插入到pCAT-Basic载体的CAT报告基因前,通过转染DF-1细胞和测定CAT表达量来评价LTR的启动子活性。HN06株和NX0101株之间,以及GD08株和CD08株之间LTR启动子活性有差异,但差异不显著;而ALV-J毒株与GD08株和CD08株之间的LTR启动子活性差异显著。     

无芒隐子草全基因组水平全长LTR反转录转座子鉴定及其中断基因分析

LTR反转录转座子是植物基因组内大量可移动的遗传因子,是基因组的重要成分之一。无芒隐子草基因组大小为543 M,全基因组中共鉴定出了299079个LTR反转录转座子,占全基因组的26.54%,但是缺少无芒隐子草全长LTR反转录转座子的研究。基于无芒隐子草全基因组序列,筛选出具有潜在活性的全长LTR反转录转座子845个,其中有410个属于Gypsy超家族,435个属于Copia超家族。对这些序列进行了系统进化树的构建和插入时间的分析,发现全长LTR反转录转座子的大量转座发生在4百万年内,插入时间较近,插入高峰期是1~1.5百万年间。筛选出被全长LTR反转录转座子中断的基因有183个,145个被中断的基因得到了GO功能注释,分析了被中断基因在不同干旱胁迫处理下的基因表达模式。对反转录转座子的鉴定有助于深入了解无芒隐子草的进化过程,为无芒隐子草全长LTR反转录转座子与中断基因的后续研究奠定基础。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

山羊关节炎-脑炎核酸疫苗研究进展

山羊关节炎脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，与其同属于一科的还有马传染性贫血、人免疫缺陷病、猴免疫缺陷病、牛免疫缺陷病、猫免疫缺陷病以及梅迪-维斯纳病毒，山羊关节炎脑炎病毒与梅迪-维斯纳病毒极为相似，二者在血清学上有多种交叉反应。山羊关节炎脑炎病毒主要侵染宿主的单核／巨噬细胞系的细胞，引起以成年山羊的关节炎以及羔羊的脑炎症状为主的慢性持续性感染。该病潜伏期长，可通过母羊哺乳及呼吸道和消化道广泛传播，又没有有效的药物和疫苗对其进行防制，使CAEV的感染呈世界性分布。     

禽内源性反转录病毒ALVE1LTR转录水平分析

本研究以禽内源性反转录病毒ALVE1为研究对象,分析了ALVE1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)自身转录的变化规律。荧光定量PCR结果显示LTR在2日龄SPF鸡(发育早期)器官组织中转录水平高,而在35日龄SPF鸡(发育晚期)器官组织中转录水平低。焦磷酸测序和荧光定量PCR关联分析发现,ALVE1 LTR在鸡巨噬细胞系HD11和鸡T淋巴细胞系MSB1细胞中的转录水平可能受DNA甲基化调控,去甲基化处理HD11或MSB1 24 h后,LTR转录水平显著增加。通过序列分析发现ALVE1 LTR高度保守且存在先天性免疫应答激活转录因子如NF-AT、c-JUN等。本研究揭示了ALVE1 LTR自身转录的变化规律,为进一步分析ALVE1 LTR功能奠定了基础。     

LTR对J亚群禽白血病病毒感染的影响

为探讨LTR基因在骨髓瘤病变型J亚群禽白血病病毒(ALV-J) NX0101致病中的作用,利用反向遗传将血管瘤病变型ALV-J HN06株中两端LTR元件替换至NX0101株的相应位置,拯救出重组病毒NX-HNLTR株.人工接种7日龄SPF雏鸡,分别检测NX0101株和NX-HNLTR株对鸡体的影响.感染鸡生长都较慢.感染NX0101株的鸡,胸腺指数和腔上囊指数明显比对照组低,脾脏指数与对照组相比波动较大,骨髓和脾脏在攻毒后3周可检测到病毒整合到基因组中,胸腺和腔上囊在攻毒后6周才检测到.感染NX-HNLTR株的鸡脾脏指数明显比对照组低,攻毒后2周可检测到病毒整合到脾脏基因组中,骨髓和胸腺分别在攻毒后3周和6周检测到.结果提示,LTR对NX0101株感染鸡的免疫器官有一定的影响.     

山羊病毒性关节炎-脑炎

山羊病毒性关节炎-脑炎(Caprine arthritis-encephalitis,CAE)是一种由反转录病毒科慢病毒属山羊关节炎-脑炎病毒(Caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)所引起的慢性、进行性传染病.该病最早出现在瑞士,随后出现于美国、澳大利亚、德国、日本及加拿大...     

鸡内源白血病病毒ev21与慢羽非连锁分析和LTR区启动子活性分析

旨在分析鸡内源ev21病毒与慢羽的连锁关系及其结构特征和启动子活性,为建立无内源ev21病毒的慢羽种鸡提供检测方法,并对ev21的启动转录活性进行探索。长片段PCR扩增获得鸡内源ev21病毒基因序列,检测太行鸡、坝上长尾鸡、海兰褐、海兰灰及其祖代五个品系259份样本的病毒携带情况。利用NCBI数据库Blast比对分析并PCR获得病毒基因全长。构建ev21基因5′和3′LTR区的pGL3-basic重组质粒转染A375细胞检测其启动子活性。结果显示:获得完整ev21病毒基因组全长7 524bp,发现其反向插入在鸡Z染色体g.10681671-10681672之间,长片段7 590bp PCR检测发现ev21与海兰灰慢羽鸡完全连锁,但与太行鸡、坝上长尾鸡和海兰褐慢羽并不完全连锁,尤其海兰褐快羽公鸡ev21全部阳性。ev21基因5′LTR区具有高强度的启动子活性(P0.01),3′LTR区活性高于阴性对照,但差异不显著(P0.05)。综上,内源ev21病毒与鸡慢羽性状并不完全连锁,7 590bp长片段PCR为内源ev21病毒的筛查提供检测方法,ev21基因5′LTR区具有强启动子活性。