利用 CRIS PR/Cas9 技术创制水稻中花 11 号 dwarf1 突变体

【目的】水稻异源三聚体 G 蛋白 α 亚基在植物生长与逆境应答中具有重要的生物学功能,在 水 稻中花 11 号品种中创制 Gα 蛋白编码基因 DWARF1（D1）的突变体,为水稻功能基因组学研究提供材料。 【方法】在中花 11 号的 D1 基因座位上设计靶向其外显子的 sgRNA 序列,构建 CRISPR/Cas9 载体,转化中花 11 号胚愈伤组织,经过抗性愈伤组织筛选和诱导分化后,对再生植株进行鉴定。【结果】筛选到 3 个含有不同编 辑形式的 d1 突变株系,实时荧光定量 PCR 分析发现,D1 mRNA 水平显著降低,表明无义突变介导的 D1 mRNA 降解过程亦被触发。在 3 个 d1 突变株中进一步鉴定到不含潮霉素抗性基因、不含载体骨架的植株,繁育后可以 得到无转基因痕迹、稳定遗传的 d1 敲除植株。对 d1 突变株的生长、发育情况进行观察发现,中花 11 号背景下 d1 突变株显著变矮、穗明显变小,株高和穗长为中花 11 号野生型的 50%~60%。种子变小及变圆,同时,种子 长宽比和千粒重降低约 40%。【结论】获得有效移码突变的中花 11 号背景 d1 突变株系,为进一步研究 G 蛋白 及其相关基因的功能创制遗传材料。     

水稻愈伤诱导过程中生长素通路的初步研究

构建水稻LBD基因家族中CRL1基因的CRISPR/CAS9基因敲除载体,并转化中花11水稻愈伤,获得了8个转基因片段缺失家系;对CRL1基因敲除材料种子进行愈伤诱导实验;结果显示,它们的愈伤组织诱导受到了强烈抑制,与已知的水稻OsIAA10基因的RNA干扰材料表型相似.进行OsIAA10的亚细胞定位实验,结果显示,O...     

水稻多胺氧化酶基因（OsPAO4）CRISPR/Cas9 编辑突变体的创制

【目的】稻瘟病是水稻生产上的重要限制因素,挖掘与利用抗病基因是实现水稻高产稳产的重要保障。前期研究发现,稻瘟病抗性相关osa-miR-21可能通过靶向调控多胺氧化酶基因OsPAO4调节水稻稻瘟病抗性,但目前多胺氧化酶(Polyamine oxidases,PAOs)在水稻抗病中的功能研究尚未见报道。为进一步探究其在水稻抗病中的可能生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9编辑技术对水稻OsPAO4基因进行定点编辑并对其后代突变体进行分析。【方法】在OsPAO4第2外显子处设计了1个20 bp的编辑靶点,将靶点核苷酸片段克隆至pRGEB32载体,获得OsPAO4编辑载体。随后,利用农杆菌介导法转化水稻Pik-H4 NIL愈伤组织中,经过再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T₀代植株靶位点附近DNA序列进行PCR和测序分析。【结果】OsPAO4基因被成功编辑,最终获得25个转基因阳性植株,并在T₀代产生多种突变类型：3株纯合突变、18株杂合突变和4株未发生编辑的植株。此外,T₀代杂合突变ospao4-8的颖壳颜色由...     

TALEN介导水稻OsTZF9基因定点突变研究

RR-TZF锌指基因在植物生长发育和胁迫反应中起着重要作用。利用TALEN基因组编辑技术定点突变水稻RR-TZF基因OsTZF9,结果表明:根据日本晴基因组中的OsTZF9基因序列,设计3对TALEN靶序列,并构建相应的3个TALEN植物敲除表达载体;通过农杆菌介导法分别将3个TALEN敲除载体导入水稻明恢86和秀水134的胚性愈伤组织中,获得了100个转化再生植株,PCR检测获得87个阳性植株;PCR扩增转基因植株靶突变区并测序列,发现所有转基因植株均未出现靶突变。     

利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因

以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因敲除载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)D3基因的3个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体,并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T_0代转基因植株靶位点测序结果显示,靶位点DDRC1包括5种突变类型,植株的突变率为35.48%;靶位点DDRC2包括5种突变类型,植株的突变率为25.00%;靶位点DDRC3包括1种突变类型,植株的突变率为20.00%。利用T_1代纯合突变植株,进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系,探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点,为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。     

CRISPR/Cas9技术定点编辑水稻谷蛋白基因GluA

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对粳稻品种‘嘉花1号’的谷蛋白基因GluA3(LOC_Os03 g31360)进行编辑获得转基因T0代植株,并对其衍生的T1代28个单株进行鉴定分析。结果表明:获得了两种类型的GluA3编辑突变植株;突变体的未成熟胚乳中GluA3 RNA表达水平明显下调;突变体谷蛋白含量呈下降趋势。对‘嘉花1号’野生型及突变体水稻农艺性状考查发现,突变体水稻穗数和产量下降明显。试验表明,CRISPR/Cas9技术可有效编辑水稻谷蛋白基因,可为水稻谷蛋白品质育种提供理论指导。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。     

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定向降低水稻落粒性

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段--CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-gRNA、U6a-qSH1T1-gRNA表达盒,最后将2个gRNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T₀代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T₀代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T₀代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T₁代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T₁代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T₂代qsh1纯合突变系群体（17SZ01和17SZ02）。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T₁代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T₂代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g ^-1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g ^-1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。     

外源生长激素对水稻T-DNA插入突变体褐飞虱抗性的影响及其农艺性状测定

[目的]分析外源生长激素对水稻T-DNA插入突变体褐飞虱抗性的影响,并测定其农艺性状,为突变基因介导的抗虫分子机理研究提供理论参考.[方法]以水稻受体中花11(ZH11)及其T-DNA插入突变体CF54为材料,利用三引物PCR鉴定出纯合突变株系,并用乙烯利(ET)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)对ZH11及其纯合突变株系进行处理,测定植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量.对ZH11及其纯合突变株系的株高、穗长、有效穗数、有效分蘖数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状进行测定.[结果]从突变体CF54后代中共筛选出10个株系,其中纯合突变株系有2个,分别为CF54-6和CF54-10.经ET、SA和MeJA处理后ZH11及其纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量较未处理对照显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)下降,但未处理对照间均无显著差异(P>0.05,下同).经MeJA处理后,纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的虫体增重量和蜜露分泌量较ZH11显著下降,但经SA和ET处理的纯合突变株系CF54-6和CF54-10植株上褐飞虱的蜜露分泌量和虫体增重量与ZH11无显著差异.纯合突变株系CF54-6和CF54-10的有效分蘖数、有效穗数和千粒重与ZH11无显著差异,但株高、穗长和每穗实粒数显著或极显著高于ZH11.[结论]ET、SA和MeJA 3种外源生长激素均能诱导水稻野生型及其纯合突变株系植株对褐飞虱的取食与生长发育产生抑制作用,尤其是MeJA抑制效果最佳,推测纯合突变株系抗虫性受茉莉酸(JA)信号途径的影响更大.T-DNA插入明显影响水稻植株的农艺性状.     

利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用

[目的]FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因.为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体.同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据.[方...     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。     

香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。     

一种CRISPR-Cas9介导的拟南芥高效基因编辑系统的构建与应用

【背景】近些年兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种植物中实现了高效的基因打靶,为基因功能研究提供了一种高效快速的方法,但一些CRISPR-Cas9载体编辑效率很低。【目的】通过构建一种由RIBOSOMAL PROTEIN S5 A（RPS5A）启动子启动Cas9并带有红色荧光蛋白筛选标记的CRISPR-Cas9载体,提高拟南芥CRISPR-Cas9编辑效率,并利用这套系统对拟南芥木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因TOUCH4（TCH4）进行编辑。【方法】在pKSE401载体的基础上,以从胚胎发育早期就表现出高转录活性的RPS5A启动子替换35S启动子、以DsRed2替换潮霉素抗性基因,构建拟南芥中使用的CRISPR载体pRSE-WH;以AtTCH4为靶基因,使用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn）设计靶位点,将所设计的靶点序列在拟南芥参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出2个靶位点target 1和target 2。化学合成带有接头的靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pRSE-WH载体连接,构建TCR1和TCR2表达载体,采用农杆菌介导的沾花法侵染野生型拟南芥Col-0,以红色荧光蛋白为标记筛选获得T₁代转基因阳性植株。通过靶位点扩增测序法判断T₁代转基因植株在预期靶位点是否发生编辑,根据测序结果的峰图对编辑情况进行解码,进一步分析突变类型及基因型。【结果】构建了一个在拟南芥中高效编辑的CRISPR载体pRSE-WH。TCR1和TCR2成功地实现了对TCH4的定点编辑,靶点一的编辑效率为80%,靶点二的编辑效率为100%,总编辑效率为86%。根据测序结果的峰图解码了T₁代植株的突变结果,纯合编辑、杂合编辑、双等位编辑均有出现。对不同的编辑类型进行统计发现,59株T₁代阳性植株中,无编辑8株,占比13.56%,纯合编辑9株,占比15.25%,双等位编辑40株,占比67.80%,杂合编辑2株,占比3.39%。在T₁代发生纯合编辑以及双等位编辑的株系中选择了无红光种子进行繁种,并对T₂代植株编辑情况进行测序检测,结果发现T₁代中的突变成功遗传到了T₂代无Cas9株系中。【结论】pRSE-WH在拟南芥中展现了极高的编辑效率,并且通过对种子进行红色荧光筛选,能够简便地获得无Cas9且稳定遗传的T₃代突变体。     

靶向加工番茄elF4E1的CRISPR/Cas9载体有效性验证

【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

【目的】生长素输出载体蛋白（PIN-FORMED,PIN）是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据。【方法】根据OsPIN9序列设计特异性编辑位点,构建OsPIN9编辑载体,以日本晴愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法获得抗性植株,通过PCR鉴定转基因植株。转基因植株通过PCR和测序明确OsPIN9的突变类型,获得ospin9纯合突变体并分析突变蛋白与野生型蛋白的差异。qRT-PCR分析突变体幼苗根部OsPINs的表达,进一步明确突变体与野生型对照植株之间的表型差异。以0.05 μmol·L^-1的萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid,NAA）处理幼苗7 d,分析NAA对植株表型的影响。【结果】在水稻OsPIN9第1外显子处设计靶点并构建表达载体,通过遗传转化成功获得18株T₀代转基因植株,测序分析发现转基因株系中有3种不同的突变方式,均为在靶位点的18位碱基处插入不同的单碱基,其中,3株插入T碱基,3株插入G碱基,1株插入C碱基,共获得基因编辑株系7株,进一步鉴定获得2种纯合突变体。序列比对分析表明,这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的426个氨基酸缩短为172个氨基酸,跨膜螺旋结构域分析表明突变体中OsPIN9蛋白的跨膜结构完全消失。qRT-PCR分析表明,2个突变株系的OsPIN9转录水平显著降低,OsPIN1a和OsPIN5b表达上调,而OsPIN5a表达受到抑制。幼苗期的表型分析表明,突变体的株高显著低于野生型,不定根数显著少于野生型,但根长没有显著变化。NAA处理下,植株的生长受到抑制,ospin9突变体的不定根数仍少于野生型,但差异已不显著。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻生长素输出载体蛋白OsPIN9进行定向编辑,可获得无转基因成分的基因编辑植株,OsPIN9的突变影响其他OsPINs的表达,ospin9突变体的地上部和地下部的发育都受到抑制,NAA处理能部分恢复突变体不定根的发育。     

农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T₁代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-1 6-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO₄显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T₀代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T₁代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

玉米pTAC2影响苗期叶片叶绿素合成的转录组分析

【目的】叶绿素是参与光合途径最为重要的光合色素。叶绿体的发育及叶绿素的合成在很大程度上依赖于质体基因组与核基因组之间的双向信号传导来精确协调基因表达。通过对白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因阳性纯合突变材料进行RNA-seq研究,筛选和鉴定参与叶绿素合成的相关基因,为明确叶绿素的合成途径奠定基础。【方法】以CRISPR/Cas9-ZmpTAC2玉米转基因编辑纯合突变株系为研究材料,使用透射电镜观察叶绿体超微结构和分光光度法测定叶片叶绿素含量,确定叶绿体发育状态及叶绿素合成情况。对转基因阴性材料（CK）和CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因纯合编辑材料（zmptac2）苗期叶片取样进行转录组测序。通过生物信息学分析,寻找CK与zmptac2间差异表达的基因;qRT-PCR对差异表达基因进行验证。通过酵母双杂交筛选与玉米pTAC2互作的蛋白质。【结果】共获得15株T₀转基因植株,包括绿色植株（7株）和白色植株（8株）。绿色幼苗中3株为转基因阴性材料,4株为转基因阳性（2株为未编辑,2株为杂合编辑突变）,白色植株(8株)均为转基因阳性纯合编辑。与CK相比,突变体（zmptac2）叶绿体发异常,叶绿素含量显著降低。RNA-seq的结果显示,CK与zmptac2之间共检测到1 367个基因差异表达,其中618个基因上调表达（zmptac2/CK）,749个基因下调表达（zmptac2/CK）。GO富集分析显示,下调基因显著富集到叶绿体和质体中。KEGG分析表明下调表达基因显著富集在苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和异喹啉生物碱生物合成等途径。选取的15个差异基因表达模式均与测序数据相一致,表明测序结果是可靠的。与CK相比,zmptac2中依赖PEP（plastid-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量显著降低,而依赖NEP（nuclear gene-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量则显著上升。通过对玉米cDNA文库筛选和互作验证,鉴定出ZmpTAC3与ZmpTAC2存在互作。【结论】ZmpTAC2突变会导致叶绿体早期生物合成受阻,该基因参与叶绿体发育及叶绿素合成,且该种作用是由ZmpTAC2调控PEP相关基因表达而实现的。