利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建水稻OsPUX2突变体

[目的]U-box蛋白是一类决定靶标蛋白特异性的E3泛素连接酶(少部分属于泛素链聚集因子-E4),在植物抗病、抗逆和生长发育各阶段都发挥着重要作用。为揭示U-box蛋白家族基因OsPUX2在水稻防御反应中的具体生物学功能,利用CRISPR/Cas9编辑技术对OsPUX2基因进行编辑。[方法]在OsPUX2第1外显子设计1个20 bp的编辑靶点,构建了OsPUX2基因敲除载体pRGEB32-OsPUX2-gRNA载体,并通过农杆菌介导的转化方法侵染水稻Pik-H4 NIL愈伤组织,经潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T₀代转基因植株进行靶点区域序列进行PCR和测序分析,分析ospux2的突变类型。[结果]成功获得了ospux2的敲除突变体材料,对突变类型的分析发现,转基因编辑后代共存在7种突变类型,以缺失突变为主,其中一种纯合突变类型在OsPUX2第一个外显子的第115号碱基处缺失了一个C碱基,导致蛋白的翻译在第84个氨基酸处提前终止。[结论]该研究获得ospux2突变株系对进一步研究该基因的功能具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现,是适应性免疫系统的一部分,现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达.同时,CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制,确定药物开发的靶标,并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究.对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展...     

利用 CRISPR/Cas9 技术定向编辑水稻 OsIQD1 基因

【目的】植物特异性 IQD 家族蛋白质是一类植物特有的钙调素结合靶蛋白,在植物的生物防 御和发育调节中发挥重要作用。前期酵母双杂筛选试验表明,Pik-H4 与 OsIQD1 存在互作关系,为进一步 揭示 OsIQD1 在水稻抗稻瘟病中的生物学功能,利用 CRISPR/Cas9 编辑技术对 OsIQD1 基因进行定点编辑。 【方法】通过序列比对获得水稻 OsIQD1。在 OsIQD1 第 1 外显子和第 5 外显子（DUF4005 结构域）区域设计 2 个 20 bp 的编辑靶点,将 2 个靶点核苷酸片段克隆至 pRGEB32 载体,获得 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 载体,利用 农杆菌介导法转化水稻 Pik-H4 NIL 愈伤组织,经再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对 T0 代转基 因植株靶点区域序列进行 PCR 和测序,分析 osiqd1 的突变类型。【结果】转基因再生植株经过对抗潮霉素基因 HPT Ⅱ的 PCR 鉴定,获得 30 株阳性株系。对 T0 代植株靶点附近序列的测序结果表明,OsIQD1 基因被成功编 辑,两个位点的编辑效率分别为 21.67% 和 26.67%,其中,靶点 2 区域有 1 个纯合突变株系。【结论】研究结 果为进一步利用 osiqd1 突变体开展其参与钙离子 / 钙调素信号转导通路的机制研究提供了遗传材料,初步推定 OsIQD1 参与植物的基础免疫反应。     

水稻突变体库构建方法的新发展——CRISPR/Cas9系统

水稻是世界上重要的粮食作物之一.随着水稻全基因组测序的完成,迫切需要开展基因组功能的研究,其中突变体的获得是至关重要的环节.构建水稻突变体库是挖掘优异种质资源、分离并鉴定基因功能最直接的办法.概括了几种早期常用的突变体库构建方法,重点介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制突变体库的研究进展.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是近年发现的继ZFNs和TALENs两种基因编辑技术之后的一种新型基因组定点编辑技术。本研究分别从CRISPR/Cas9系统的结构、类别、作用机制、相关应用以及存在问题等方面进行综述,旨在为相关领域研究提供参考。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

[目的]OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程.利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11 (ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻...     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除OsFAD2创制高油酸水稻突变体

【目的】水稻 OsFAD2 编码脂肪酸脱饱和酶,调节油酸（C18∶1）向亚油酸（C18∶2）转化,该基因突变后可提高水稻的油酸含量。为了创制高油酸水稻突变体并助力稻米油发展,利用 CRISPR/Cas9 技术对OsFAD2 进行定点编辑。【方法】以日本晴（粳稻）愈伤组织为材料,利用含有 CRISPR/Cas9-FAD2-sgRNA 载体的农杆菌介导获得转基因植株,Sanger 测序与荧光定量 PCR 鉴定阳性植株,最后利用气相色谱质谱（GC-MS）检测稻米籽粒脂肪酸含量变化。【结果】靶点序列测序检测表明 , 有 3 株OsFAD2敲除植株在 T0代产生了碱基变异,但是仅有 1 株不存在脱靶现象。随后阳性植株种子被扩繁至 T1 代,使得 OsFAD2 突变序列纯和、稳定,荧光定量 PCR 检测表明 OsFAD2 表达量比野生型植株显著减少。利用 T1 代转基因植株进行种子脂肪酸组分检测表明,敲除 OsFAD2 导致籽粒油酸含量显著上升约 30%。【结论】利用 CRISPR/Cas9 技术对水稻 OsFAD2 编码区序列进行靶向敲除并获得了高油酸水稻突变体,为后续高油酸稻米育种提供种质资源。     

利用CRISPR∕Cas9技术编辑水稻丙酮酸磷酸双激酶基因PPDK

采用CRISPR/Cas9技术,以水稻丙酮酸磷酸双激酶基因PPDK为靶基因,构建载体,用农杆菌介导的方法转化粳稻品种'嘉花1号',获得1个碱基A缺失的编辑突变植株ppdk3.该突变体米粒的胚乳为白色粉质,其淀粉颗粒变小,结构松散,I-KI染色溶液颜色明显比野生型浅,直链淀粉含量下降约5％,抗性淀粉含量略有增加.与野生型...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的水稻定向改良研究进展

水稻（Oryza sativa L.）是单子叶植物研究的模式作物,同时也是世界上最重要的粮食作物之一。我国是世界上最大的稻米生产国和消费国,水稻在保障粮食安全方面发挥着极其重要的作用。水稻品种的不断改良升级是保障稻米稳产增产的有效途径。以育种家经验为基础的传统育种方式的育种周期长、精准性差、可预见性低,已逐渐不能满足现代育种需求。CRISPR/Cas9 是继锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）等技术之后的新一代基因编辑技术,能在不改变受体遗传背景的前提下,精准、定向地改造控制重要性状的功能基因以达到性状快速升级改良的目的,已逐步成为动植物科学研究和作物育种的重要工具。目前CRISPR/Cas9 基因编辑技术已经广泛应用于水稻重要性状的定向改良和种质资源创新研究。综述了 CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理及其在水稻抗病性、品质、育性、非生物胁迫等方面的研究进展,并对 CRISPR/Cas9技术的发展和未来在水稻育种中的应用进行了展望,为未来 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在作物定向改良中的进一步利用提供参考。     

水稻多胺氧化酶基因（OsPAO4）CRISPR/Cas9 编辑突变体的创制

【目的】稻瘟病是水稻生产上的重要限制因素,挖掘与利用抗病基因是实现水稻高产稳产的重要保障。前期研究发现,稻瘟病抗性相关osa-miR-21可能通过靶向调控多胺氧化酶基因OsPAO4调节水稻稻瘟病抗性,但目前多胺氧化酶(Polyamine oxidases,PAOs)在水稻抗病中的功能研究尚未见报道。为进一步探究其在水稻抗病中的可能生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9编辑技术对水稻OsPAO4基因进行定点编辑并对其后代突变体进行分析。【方法】在OsPAO4第2外显子处设计了1个20 bp的编辑靶点,将靶点核苷酸片段克隆至pRGEB32载体,获得OsPAO4编辑载体。随后,利用农杆菌介导法转化水稻Pik-H4 NIL愈伤组织中,经过再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T₀代植株靶位点附近DNA序列进行PCR和测序分析。【结果】OsPAO4基因被成功编辑,最终获得25个转基因阳性植株,并在T₀代产生多种突变类型：3株纯合突变、18株杂合突变和4株未发生编辑的植株。此外,T₀代杂合突变ospao4-8的颖壳颜色由...     

CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术是在DNA双链的特定位置形成双链断裂,然后通过同源重组或非同源末端连接方式进行修复,造成基因组碱基局部缺失或插入而引起基因突变,它具有操作简单、突变效率高等优势。笔者归纳了CRISPR/Cas9系统的基本结构、分类及其在植物基因中的研究进展和未来的发展方向。     

水稻成花素家族OsDTH11基因的CRISPR/Cas9编辑突变体的创制

水稻成花素家族基因在水稻的开花结实过程中发挥重要作用。水稻基因组中共有19个成花素相关基因,其中Hd3a和RFT1基因已被证实能够促进水稻抽穗开花,其余成花素成员功能未知。本文针对水稻成花素家族成员OsDTH11基因,基于CRISPR/Cas9技术构建了基因编辑载体,并通过农杆菌介导的遗传转化方法成功获得了该基因的敲除突变体。经测序验证发现了2种类型的突变体,一种是纯合的62 bp缺失突变体,另一种是31 bp缺失的杂合突变体。通过自交分离分别获得两种类型稳定遗传的纯合突变体材料,为OsDTH11基因的生物学功能与水稻开花分子机制研究奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低,对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难,位点特异性核酸酶的出现和应用,大大提升了同源重组的效率,使基因组编辑变得更加高效和精确,从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。锌指核酸酶（ZFN）和TALE核酸酶（TALENs）是能够使DNA的靶位点产生DNA双链断裂进而实现基因组定点编辑的常用系统,但在具体应用中发现这两种系统存在着许多缺陷和不足,如脱靶效应、与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等,另外技术难度大、构建组装时间长也限制了其应用。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经过密码子优化等改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,具有突变效率高、制作简单、易操作及成本低的特点。目前,该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的indel突变等。目前,CRISPR/Cas系统在植物中的应用还比较有限,但该技术为植物基因工程的发展呈现了美好的前景。文中首先简要介绍了CRISPR/Cas系统的组成和基本原理,进而详细综述了该技术在植物内源基因和外源基因定点编辑中的应用,主要列举了自CRISPR/Cas系统改造成功以来利用该系统对单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望,希望能够为开展该领域研究的科研工作者提供参考。     

CRISPR/Cas9技术敲除水稻BR降解相关基因的研究

油菜素内酯(BR)是一种常见的植物类激素,在植物的生长发育过程中起重要的调控作用,对水稻株型改良和抗逆性有重要作用。研究首先构建了水稻4个BR降解相关基因的CRISPR/Cas9载体;然后利用农杆菌介导法,将构建好的4个BR降解相关基因的CRISPR/Cas9载体分别转化水稻中花11的愈伤组织,用50 mg/L的潮霉素作为筛选标记,共获得395株转基因植株。其中,有270株属于野生型,61株属于杂合子类型,64株属于突变类型;64株突变体中有39株是杂合突变体,25株是纯合突变体,纯合突变的概率为6.25%。4个基因均获得了突变材料,但不同基因的突变效率不同,其中转LW26的植株突变率高达41%。