广西柑橘黄龙病发生情况及黄龙病菌的遗传多样性分析

【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病（Huanglongbing,HLB）危害情况及黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2个年度（2020和2021年）的跟踪调查并随机采集1048份柑橘叶片样品,利用qPCR技术对采集的样品进行CLas检测,并对阳性样品CLas菌株的基因组高变区的扩增产物进行测序,分析CLas菌株的遗传多样性。【结果】与2020年相比,除采自百色的柑橘样品CLas检出率2个年度保持不变（14.29%）外,2021年采自玉林、桂林、河池、梧州、南宁、贺州和来宾的柑橘样品CLas检出率均呈上升趋势,其中2021年采自梧州的柑橘样品CLas检出率最高（52.94%）。不同种类柑橘的CLas检出率差异明显,2021年甜橙类、柚类、杂交柑类和金柑类的样品CLas检出率均较2020年升高,2个年度的宽皮柑橘类CLas检出率相同（14.29%）。不同症状类型的柑橘样品CLas检出率也存在较大差异,其中2021年采集的缺素黄化型样...     

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和La...     

马蜂柑响应黄龙病菌不同侵染时期的生物学和转录组学分析

【目的】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。【方法】以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月(最早检测到CLas阳性)作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。【结果】症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰...     

黄龙病菌在4个品种柑橘果枝内的时空分布

目的 亚洲种韧皮部杆菌(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, CLas)是引起柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)的优势种,也是引发我国柑橘HLB的唯一病原菌。探索CLas在柑橘果枝内的时空分布规律,有利于及时准确地对其进行检测,对HLB的防控具有重要意义。方法 以砂糖橘、W?默科特、红心蜜柚和沙田柚不同生长期的果枝为材料,利用实时荧光定量PCR检测果枝CLas含量,研究其时空分布规律。结果 CLas在病枝中分布不均匀,在果实处(橘络、果中轴或种皮)富集。对于宽皮柑橘的砂糖橘和杂柑的W?默科特,成熟期果实橘络中的CLas含量最高;而对于柚类的红心蜜柚和沙田柚,成熟期果轴中的CLas含量最高。砂糖橘果实膨大与成熟过程中,CLas随着营养物质的流动从源器官(叶片)向库器官(果实)分流并聚集;果轴和橘络中的CLas含量不断增加,且橘络中的CLas含量显著上升。结论 CLas随着柑橘果实生长和成熟而汇集,结合源库理论可解析CLas在果枝上的运转和分布规律。     

携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

[背景]在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展.前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙...     

柑橘黄龙病菌基因组学的研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害,严重威胁着世界柑橘产业的发展。该病害由难培养细菌——候选韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)所引起,通过带病苗木和媒介昆虫进行传播蔓延。近年来,随着DNA测序技术和生物信息学的发展,基因组学被广泛应用于柑橘黄龙病的研究,并为克服黄龙病菌难培养所造成的研究瓶颈提供了新的方法和思路。柑橘黄龙病菌基因组学的研究,不仅有助于探究黄龙病菌与寄主植物的互作关系,而且可为抗病栽培和病害早期检测提供重要的理论基础。本文结合当前柑橘黄龙病的研究概况、病原全基因组的测序策略及基因组的特征描述,重点综述基因组学在黄龙病致病机理、病原遗传多样性与分子检测等方面的研究进展。     

基于不同位点的广东省柑橘黄龙病菌种群分子多样性分析

【目的】探究广东省不同地区柑橘黄龙病菌"Candidatus Liberibacter asiaticus"(CLas)的种内遗传结构及遗传多样性情况;评价用多基因位点分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的科学性。【方法】基于原噬菌体区域(SC1、SC2和PJXGC)、转座子位点(CLIBASIA_05620～CLIBASIA_05625)和短串联重复序列STR1(CLIBASIA_03080)、STR12(CLIBASIA_01215)6个基因位点的多态性,对来自广东省10个市(县)的176个黄龙病样品进行病原菌遗传多样性分析。【结果】基于噬菌体类型鉴定出6组菌株,其中携带Type II类型原噬菌体的菌株为优势种群(85.23%);基于转座子位点鉴定出4种类型菌株,含有缺失MCLas-A类型转座子的B350片段的菌株为优势种群(76.70%);基于短串联重复序列STR1和STR12分别鉴定出9和10类菌株,且STR1位点上含有3个"CAGT"串联重复的菌株为优势种群(56.82%);STR12位点上多态性条带分布不集中,没有优势条带类型。聚类分析结果表明湛江、茂名和深圳的种群与其他地区种群的差异较大,而清远和梅州的黄龙病菌种群关系较近。【结论】基于不同位点和基于所有位点所得的聚类结果不尽相同,说明利用单个或单种基因位点对黄龙病菌进行种群遗传结构分析具有较大的局限性。     

膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

[背景]柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)侵染引起的一种柑橘病害.对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等.前3种方法都需要依靠准确的...     

柑橘黄龙病菌在柑橘病树不同部位中的定量分布情况研究

采用实时荧光定量PCR检测了柑橘黄龙病菌在广东省阳江市4个柑橘品种9个不同部位中的定量分布情况,为病害防控提供依据.结果 表明,柑橘成熟叶片的叶脉样品和叶肉样品中的黄龙病菌靶标基因平均含量分别为5210808.08和1328972.53拷贝/每克植物组织,均显著高于柑橘新叶的叶脉样品和叶肉样品(分别为18274.26和...     

RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其植物表达载体构建

文章采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物;采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子,利用酶切连接方法,将该基因正向导入植物表达载体。经过相关检验,结果表明,TGA2转录因子正向插入中间载体的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,成功构建包含TGA2转录因子的p35ST-TGA2植物表达载体。     

土霉素处理对柑橘黄龙病的防治效果及PP2基因表达的影响

【目的】评价土霉素(oxytetracycline,OTC)药剂对不同发病程度柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）的防治效果,并检测OTC处理后韧皮部关键基因——韧皮部蛋白2（PP2）的表达量变化,为HLB的有效防控提供科学依据,也为OTC作用机理研究提供参考。【方法】应用可有效抑制、杀死病原菌的OTC,树干定量注射0.1 g/树于不同发病程度HLB（初感染、轻度发病和重度发病3组）的4年生Valencia夏橙,注射后7、30、60、90 d定期采集Valencia叶片样品监测HLB致病菌Cadidatus Liberibacter asiaticus(Las)含量、淀粉含量及PP2基因表达量变化。树干注射OTC后90 d采集不同处理Valencia的嫩叶、成熟叶片及茎,进行淀粉染色光学显微观察（LM）,直观反映植株累积淀粉的变化。树干注射OTC后80 d调查柑橘嫩叶抽发的情况,综合一系列指标评价OTC对HLB的防治效果。【结果】注射OTC 0.1 g/树对初感染HLB的4年生Valencia植株治疗作用最明显,7 d后检测即为阴性,并可保持90 d,其成熟叶片的淀粉含量明显减少,但茎内仍有淀粉粒富集;轻度发病夏橙注射90 d后叶片内的Las含量从（1.68×10 ⁶±858884）cells/g叶片减至（7.21×10 ⁴±30981）cells/g叶片,下降幅度极为明显,其成熟叶片内的淀粉含量在90 d内一直呈下降趋势;重度发病植株注射后叶片内的Las含量从（4.10×10 ⁸±3.04×10 ⁸）cells/g叶片减至（2.80×10 ⁷±2.70×10 ⁷）cells/g叶片,但从数量而言仍然有较多分布,除了新长出的秋梢,其成熟叶及茎内的淀粉粒含量仍旧很大,说明0.1 g/株OTC不足以治愈4年生重度发病Valencia夏橙。对PP2基因表达分析结果显示,注射OTC后30 d,Valencia夏橙体内的PP2基因表达量大幅度下降,随后90 d内表达量稳定,与注射后30 d的表达量较为一致。 【结论】OTC可以用于HLB的防控,对初感染（Las含量为<9.00×10 ⁵cells/g叶片）及轻度发病（Las含量为9.00×10 ⁵—9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的柑橘植株治疗作用较好,不适用于重度发病植株（Las含量为>9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的治疗。注射OTC后,PP2基因表达量下降明显,说明OTC可有效减少韧皮部病菌等的胁迫压力。     

柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

【目的】活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘(甜橙)CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员(CsRboh01—CsRboh07),其编码蛋白包含784—946个不等的氨基...     

金针菇JA/SA信号通路基因鉴定及其对外源JA/SA应答

本研究鉴定了金针菇茉莉酸(JA)信号通路的4个关键基因:COI1、PDF1.2、MYC2-1、MYC2-2与水杨酸(SA)信号通路的4个关键基因:PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2。NBT染色法和荧光定量结果表明,金针菇JA/SA信号通路可应答外源JA/SA,50μmol·L~(-1)外源JA和500μmol·L~(-1)外源SA处理金针菇菌丝12h可显著提高JA/SA信号通路基因的转录水平,基因PDF1.2响应JA诱导最明显,可作为JA信号通路标记基因;JA/SA信号转导途径间存在协同或拮抗作用:SA信号转导通路中NPR1蛋白对JA信号转导通路中PDF1.2基因表达有抑制作用,外源JA/SA的相对浓度决定其作用的强弱。     

舞毒蛾气味结合蛋白基因克隆及对CO2胁迫的响应

气味结合蛋白（OBPs）可以特异性地结合并运输气味分子,在昆虫嗅觉系统感受气味分子过程中发挥重要作用。为探讨舞毒蛾OBP基因特性及对CO₂浓度升高的响应规律,克隆了2个舞毒蛾OBP基因,利用生物信息学分析其基因特性,并通过qRT−PCR技术研究不同CO₂浓度下OBP基因组织特异性表达。结果表明LdOBP1和LdOBP2基因开放阅读框（ORF）分别为450 bp和417 bp,编码149和138个氨基酸,蛋白质分子量为19.41 kDa和15.35 kDa,理论等电点为11.17和6.73,LdOBP1为碱性蛋白,LdOBP2为酸性蛋白。LdOBP1和LdOBP2均无明显跨膜区域,LdOBP1无信号肽序列,而LdOBP2在1～22位有信号肽序列。进化树分析表明舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2分别与桃小食心虫OBP（AYD42195.1和AYD42180.1）亲缘关系较近。舞毒蛾OBPs基因均在幼虫头部表达水平最高。高浓度CO₂下显著抑制了舞毒蛾幼虫各组织LdOBP1基因的表达,而LdOBP2基因在高浓度CO₂下头部和中肠表现出不同程度的诱导上升。舞毒蛾OBPs基因均在成虫触角表达水平最高,高浓度CO₂下显著抑制舞毒蛾雌、雄成虫触角LdOBP1和LdOBP2基因表达。舞毒蛾可能通过调控各组织OBPs基因的表达水平来响应CO₂胁迫。     

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（Al GRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

【目的】克隆绿盲蝽(Apolygus lucorum)G蛋白偶联受体激酶2基因(AlGRK2)cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素(20E)对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数(发育历期、若虫体重及成虫羽化率)的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区(RGS,54—175 aa)、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(S-TKc,191—454 aa)、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分(S-TK-X,455—534 aa)和PH结构域(PH,558—655 aa),其中...     

拟南芥SOAR1基因响应ABA与渗透胁迫的表达分析

拟南芥PPR蛋白SOAR1是ABA信号转导的关键调节因子。为阐明SOAR1基因表达对ABA和渗透胁迫的响应,以及其对不同时期幼苗生长响应ABA的调控,通过拟南芥基因调控信息网站(AGRIS)分析了SOAR1基因上游可能的转录因子结合位点(顺式作用元件),并进行了不同时期幼苗受ABA诱导的生长抑制试验以及ABA处理、渗透胁迫条件下SOAR1基因的表达分析。结果表明,SOAR1启动子序列中存在多个潜在的应答ABA和逆境胁迫信号的顺式作用元件。SOAR1调控不同时期幼苗生长对ABA的敏感性,SOAR1表达调低的突变体soar1-2显著促进植物对ABA的敏感反应,而SOAR1过表达株系OE1则对ABA显著不敏感。基因表达分析结果显示,SOAR1表达量在低浓度ABA处理6 h后小幅度上调,高浓度ABA处理6 h后变化程度较低;而在低浓度ABA处理后萌发24 h的种子和生长7 d的幼苗中,SOAR1表达随ABA浓度增长而上调。在甘露醇和PEG-6000诱导的渗透胁迫处理后,SOAR1表达受到一定抑制。     

白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白的克隆、定位及表达分析

 【目的】克隆受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因,分析其在感、抗病单株中的表达模式,探讨其在小麦抗白粉病过程中的作用机制。【方法】根据基因芯片结果,结合电子克隆与RT-PCR方法,克隆到一个受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因。通过中国春缺体-四体系对获得的基因片段进行定位。运用荧光定量PCR方法分析了该基因片段在抗病植株、感病植株白粉菌诱导的时空表达模式。【结果】获得了一个具有完整开放阅读框的小麦类萌发素蛋白基因片段,命名为TaGLP5(GenBank 登录号为FJ594470)。系统进化分析表明该基因片段与已知的来自禾本科的萌发素蛋白分属不同的进化分支,很可能是新的小麦萌发素蛋白成员。通过中国春缺体-四体系将该基因片段定位在小麦的5A染色体上。定量PCR分析结果表明,该基因的表达受白粉菌诱导,且在接菌后的24 h以前抗病中的表达量高于同期感病株。【结论】本实验获得的类萌发素蛋白是一个新的成员。该类萌发素蛋白在感、抗植物受白粉菌诱导上调表达,但是表达量、表达时间上存在差异。推测该基因参与了小麦对白粉菌的防御反应。