苏博美利奴羊胚胎期WNT2基因的组织表达及其生物信息学预测分析

【目的】检测WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d不同组织中的表达水平,了解WNT2基因的分子结构和进化特征,从分子水平及进化特征上研究苏博美利奴羊的组织器官与WNT2基因表达之间的内在联系,为筛选细毛羊毛囊发育相关候选基因提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR法研究苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达,并使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子,并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化,使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性,并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。【结果】WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子,4种碱基呈现均匀分布,CAG与UCU是使用相对较多的密码子,对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他哺乳动物进行比较时更为接近。【结论】建立了胚胎期135 d的苏博美利奴羊的不同组织中WNT2基因表达量的RT-PCR方法,并使用生物信息学软件对其分子结构和进化特征进行分析。     

山羊Kruppel样转录因子家族在前体脂肪细胞分化中的表达模式及相关性分析

【目的】 优化山羊前体脂肪细胞体外培养体系,揭示Kruppel样转录因子家族（KLFs）成员在前体脂肪细胞分化过程中的表达模式。 【方法】 于四川省简阳大哥大牧业有限公司随机选取3只7日龄简州大耳羊为研究对象。放血致死并清洗后,在无菌环境中取其皮下脂肪组织。利用Ⅰ型胶原酶消化法获得其皮下前体脂肪细胞,待细胞长至细胞密度为80%时传代至6孔培养板中（F₃代）,以“150 μmol·L ^-1油酸+10 mg·L ^-1胰岛素”前体脂肪细胞进行成脂诱导,并在诱导分化后0 d、3 d、5 d、7 d收集细胞,Trizol法提取细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测KLF2-10, KLF 12和KLF15共11个KLF转录因子家族成员在不同分化阶段细胞中的表达水平,并利用皮尔逊系数分析各个成员mRNA总体表达水平之间的相关性。 【结果】 150 μmol·L ^-1油酸+10 mg·L ^-1胰岛素处理前体脂肪细胞24 h后细胞中开始出现小脂滴,48 h后脂滴数量增多、体积增大,诱导120 h后脂肪细胞分化程度显著增加。RT-qPCR结果显示,脂肪分化标志基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）基因随着诱导分化的进行其表达水平持续上升,其中在第7天时其表达水平极显著高于其他各组（P＜0.01）。KLF2、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7和KLF15在脂肪细胞中表达水平显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于前体脂肪细胞中表达水平,其中KLF3、KLF6和KLF15在分化5 d时表达水平最高,KLF2和KLF4表达水平在7 d时最高,而KLF7则在3 d时表达水平最高;KLF5、KLF8、KLF9、KLF10和KLF12在前体脂肪细胞中的表达水平极显著高于分化后脂肪细胞中的表达水平（P＜0.01）,其中KLF8、KLF10和KLF12的表达水平均在5 d时达到最低,而KLF5和KLF9则在7 d时表达水平最低;相关性分析结果显示KLF家族各成员mRNA在山羊前体脂肪细胞分化过程中总体表达水平存在相关性,KLF12与6个基因具有较强的相关性,其次为KLF4和KLF9,分别与5个成员具有较强的相关性,而KLF2与其他基因均没有较强的相关性。 【结论】 明确了KLF家族在山羊前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,解析了各个成员mRNA表达之间的相关性,为阐明山羊前体脂肪细胞分化的分子机制提供重要的基础数据。     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

光照强度对樱桃谷肉鸭c-fos、生物钟基因表达 及褪黑激素的影响

【目的】研究持续黑暗下给予樱桃谷肉鸭不同强度的瞬时光照,对下丘脑、间脑、垂体和中脑中c-fos基因及相关生物钟基因的表达及血浆和肝脏中褪黑激素含量的影响。【方法】选用144只健康且体重接近的1日龄樱桃谷肉鸭饲养至21日龄,22日龄时随机分为2组,每组6个重复,持续黑暗7 d,期间自由采食和饮水,分别采用10 Lx和80 Lx的LED白光刺激1.5 h,暗适应1.5 h后立即从每个重复选取1只接近平均体重的肉鸭,检测下丘脑、间脑、垂体和中脑c-fos和生物钟基因的表达量,检测血浆和肝脏褪黑激素含量。【结果】10 Lx组的下丘脑和中脑c-fos表达量显著高于80 Lx光照组（P＜0.05）,间脑中c-fos的表达量显著低于80 Lx光照组（P＜0.05）,两组垂体组织中c-fos表达无显著影响（P＞0.05）。与80 Lx组相比,10 Lx组下丘脑生物钟基因Bmal1、Bmal2、Clock和Per2表达量均显著提高（P＜0.05）,Cry1表达量也有提高的趋势。10 Lx组间脑Bmal1的表达量显著提高（P＜0.05）,Bmal2、Clock、Per2和Cry1的表达量无显著差异（P＞0.05）。10 Lx组中脑Clock和Per2的表达量显著高于80 Lx组（P＜0.05）,两组Bmal1、Bmal2和Cry1表达无显著影响（P＞0.05）。不同强度的瞬时光照对垂体中生物钟基因的表达无显著影响（P＞0.05）。与80 Lx组相比,10 Lx组肉鸭血浆中褪黑激素含量显著降低（P＜0.05）,肝脏中褪黑激素含量显著升高（P＜0.05）。【结论】持续黑暗下,短暂高光强刺激可抑制下丘脑和中脑c-fos的表达,而提高间脑c-fos基因的表达,同时减弱了肉鸭下丘脑和间脑生物钟基因表达的振幅。     

miR-31-5p对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。     

SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响

【目的】为了探索秦川牛（Bos taurus）SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1（NM_001077107.2）已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列siSMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-bSMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列siSMAD1和过表达腺病毒AD-bSMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%（诱导1d,P<0.01）、66.7%（诱导3d,P<0.01）、60.0%（诱导6d,P<0.01）、54.7%（诱导9d,P<0.01）。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10 ¹⁰pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-bSMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-bSMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍（诱导1d）、3.19倍（诱导3d）、105.3倍（诱导3d）,P<0.01）和144倍（诱导9d,P<0.01）;结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。 【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列siSMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。     

山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

LncFAM200B对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

【目的】拟通过腺病毒介导的超表达及siRNA干扰试验,分析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的影响,为解析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的调控机制奠定基础。【方法】采集牦牛背最长肌组织,采用酶消化法和差速贴壁法分离牦牛肌内前体脂肪细胞;构建包装lncFAM200B超表达腺病毒,设计合成其siRNA干扰序列;通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析lncFAM200B超表达与干扰后脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1、PTEN的表达水平;采用油红O染色、甘油三酯（TAG）测定、CCK-8检测等方法检测细胞内脂滴沉积情况、甘油三酯含量变化及细胞增殖情况。【结果】从牦牛背最长肌成功分离获得肌内前体脂肪细胞;lncFAM200B超表达后,脂肪分化标志基因C/EBPα、AP2表达量显著升高（P<0.05）,随着诱导分化时间的增加,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1表达量呈先降低后升高的趋势,PTEN表达量呈现先增高后降低趋势;细胞脂滴沉积显著增加（P<0.05）,且胞内形成较大脂滴;超表达4 d后,细胞内甘油三酯含量显著增加（P<0.05）。干扰lncFAM200B可显著降低脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2的表达水平（P<0.05）,降低细胞脂肪沉积,且诱导分化第6天细胞内甘油三酯含量显著降低（P<0.05）;干扰lncFAM200B后其潜在靶基因SIRT1呈现先升高后降低的表达趋势,PTEN则相反。CCK-8增殖实验表明,lncFAM200B超表达72 h后,细胞增殖效率显著降低（P<0.05）,而干扰lncFAM200B后72 h后细胞增殖效率显著增强（P<0.05）。【结论】lncFAM200B可能通过影响脂肪分化标志基因C/EBPα和AP2,脂肪合成相关基因SIRT1和PTEN的表达从而影响牦牛肌内脂肪沉积,但其具体机制还需要进一步研究。     

新疆褐牛与安格斯牛胴体及肉质性状及脂代谢相关基因表达差异比较

【目的】探明新疆褐牛与国外优良品种安格斯牛产肉性能及肉品质差异、体脂代谢相关基因及其产物表达的品种间的差异性。【方法】选择相同饲养管理条件下24月龄新疆褐牛和安格斯牛进行屠宰试验,测定其胴体性状和肉品质性状;采集背最长肌和皮下脂肪,采用石蜡切片技术观测脂肪组织和肌肉组织形态学差异;利用实时荧光定量PCR检测脂肪酸合成酶（fatty acid synthesase,FAS）、脂肪酸结合蛋白4（fatty acid-binding protein 4,FABP4）、激素敏感酯酶（hormone-sensitive lipase,HSL）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）和瘦素（Leptin,LEP）基因mRNA表达量;采用蛋白免疫印迹（Western blot）测定FAS、HSL、LPL蛋白表达水平。【结果】1）新疆褐牛净肉率极显著高于安格斯牛（P＜0.01）,而背膘厚度显著低于安格斯牛（P＜0.05）。其余所测定的胴体性状相关指标均无品种间差异（P＞0.05）。2）新疆褐牛肉色L*显著低于安格斯牛（P＜0.05）;新疆褐牛平均肌纤维直径和横截面积均显著大于安格斯牛（P＜0.05）;新疆褐牛皮下脂肪组织单位面积脂肪细胞个数极显著多于安格斯（P＜0.01）,其余所测定的肉品质性状相关指标均无品种间差异（P＞0.05）。3）新疆褐牛与安格斯牛背最长肌和皮下脂肪FAS、FABP4、HSL、LPL、LEP等5个基因mRNA表达量均差异不显著（P＞0.05）;新疆褐牛背最长肌组织中FAS蛋白表达量极显著低于安格斯牛（P＜0.01）;HSL蛋白表达量显著低于安格斯牛（P＜0.05）;新疆褐牛皮下脂肪组织中HSL蛋白表达量显著低于安格斯牛（P＜0.05）。【结论】研究发现新疆褐牛产肉性能较好;但安格斯牛肉色较亮,且嫩度较好,体肪沉积能力较强。两品种间脂代谢相关基因产物FAS和HSL蛋白差异可能与安格斯肉牛背膘厚度差异有关。     

基于CRISPR/Cas9技术建立IGF2R基因修饰PK-15细胞

作为我国特色的地方种质资源,藏猪对高海拔、低氧、强紫外线辐射等恶劣环境具有良好的适应性,前期研究发现藏猪的IGF2R（insulin-like growth factor 2 receptor,IGF2R）基因在其内含子上有1段274 bp的缺失,且该缺失为藏猪独有的变异,关于IGF2R是否参与藏猪对低氧等恶劣环境的适应性调节的相关研究尚未报道。为了建立IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,研究IGF2R基因对藏猪低氧耐受特性的影响,通过CRISPR/Cas9技术建立基因修饰PK-15细胞系,并通过PCR、实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）、蛋白免疫印迹（Western-blot）、免疫荧光（immunofluorescence,IF）等方法鉴定其分子特征,随后分别利用CCK-8和RT-qPCR 、Western-blot对基因修饰细胞进行活力和凋亡基因检测。结果显示,已成功构建IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,IGF2R基因表达量极显著下调（P < 0.01）。基因修饰细胞活力在72 h时极显著上升（P < 0.01）,并且含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase9）和BCL-2关联 X （BCL2-associated X,BAX） 蛋白的水平显著下调（P < 0.05）,并且B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL2）基因的mRNA水平极显著上升（P < 0.01）。成功构建了IGF2R基因精确修饰的PK-15细胞系,并初步进行了功能研究,为研究IGF2R基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑猪的制备奠定基础。     

补喂L-瓜氨酸对种公马精液品质、精清和血浆抗氧化能力的影响

【目的】 研究补喂L-瓜氨酸对配种期种公马精液品质、精清和血浆抗氧化能力的影响。【方法】 选择年龄5~8岁的种公马12匹,平均采精量为(59.34±5.23) mL,随机分为对照组和试验组2组,每组6匹。所有马匹在相同的饲养环境下,饲喂相同营养水平的日粮,试验组马匹在此基础上补喂20 g/d L-瓜氨酸。【结果】 (1)补喂L-瓜氨酸能够极显著提高采精量和精子直线运动率,比对照组分别提高28.08%(P＜0.01)和19.12%(P＜0.01);(2)补喂L-瓜氨酸能够极显著提高精清SOD活力和抑制羟自由基的能力(P＜0.01),显著提高GSH-PX的活力(P＜0.05),极显著降低MDA的浓度(P＜0.01);(3)补喂L-瓜氨酸能够极显著提高血浆CAT、GSH-PX的活力(P＜0.01)和T-AOC、抑制羟自由基的能力(P＜0.01),极显著降低MDA的浓度(P＜0.01)。【结论】 对配种期种公马补喂20 g/d L-瓜氨酸能够提高种公马精液品质和精清、血浆的抗氧化能力。     

新疆小麦籽粒过氧化物酶(POD)活性检测及其基因等位变异检测

【目的】 研究新疆小麦品种(系)过氧化物酶活性高低并分析相关基因变异类型和分布,为新疆小麦育种和品质的遗传改良奠定基础。【方法】 分别利用TaPod-A1和TaPod-D1基因位点的显性互补功能标记TaPod-3A1/TaPod-3A2和TaPod-7D1/TaPod-7D6对113份新疆小麦品种(系)进行分子标记检测,结合新疆小麦材料POD活性的测定结果,分析POD活性相关基因不同等位变异对小麦籽粒POD活性的影响,验证TaPod-A1和TaPod-D1基因位点功能标记有效性的同时,对新疆小麦材料POD相关基因的等位变异分布频率进行分析。【结果】 新疆小麦品种(系)中,在TaPod-A1位点,具有TaPod-A1b基因型的小麦品种(系)POD活性(2 595.3 U/(g·min))极显著(P<0.01)高于具有TaPod-A1a基因型的材料(2 346.0 U/(g·min)),2种基因型的分布频率分别为36.3%和63.7%;在TaPod-D1位点,具有TaPod-D1b基因型的小麦品种(系)POD活性(2 503.9 U/(g·min))显著(P<0.05)高于具有TaPod-D1a基因型的材料(2 376.9 U/(g·min)),2种基因型的分布频率分别为46.9%和53.1%。在113份新疆小麦材料中,共检测到TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1a/TaPod-D1b、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b 4种变异组合类型,在新疆小麦中的分布频率分别为31.9%、31.9%、21.2%和15.0%。TaPod-A1b/TaPod-D1b(2 706.2 U/(g·min))类型的POD活性显著(P<0.05)高于TaPod-A1a/TaPod-D1a(2 283.6 U/(g·min))。【结论】 新疆小麦品种(系)以TaPod-A1a(低POD活性)和TaPod-D1a(低POD活性)等位变异类型为主;TaPod-A1和TaPod-D1的功能标记均能较好的区分小麦籽粒POD活性的高低,将2个位点特异性标记结合起来使用,有效地筛选出高POD活性的材料,提高新疆小麦品种(系)优异等位变异的频率,促进新疆小麦品质的遗传改良。     

新疆春小麦品种Pins基因等位变异及其对新疆拉面加工品质的影响

【目的】检测新疆春小麦品种Pins等位变异分布规律,分析不同Pins基因型春小麦品种籽粒硬度的差异,探讨Pins对春小麦品种主要品质性状和新疆拉面加工品质的影响,明确籽粒硬度影响新疆拉面加工品质的分子遗传基础及机理。【方法】以386份新疆春小麦品种资源为材料,用分子标记检测籽粒硬度Pins,测定品质性状（籽粒性状、磨粉品质、面粉品质、面团特性、淀粉糊化特性等）,制作新疆拉面并进行评鉴。【结果】Pins等位变异分布规律：在新疆春小麦品种资源中,Pina有2种等位变异,分别为Pina-D1a（占比86.79%）、Pina-D1b（13.21%）;Pinb有3种等位变异,分别为Pinb-D1a（64.77%）、Pinb-D1b（32.12%）和Pinb-D1p（3.11%）;Pina/Pinb有6种基因型组合,分别为Pina-D1a/Pinb-D1a（58.81%）、Pina-D1a/Pinb-D1b（25.39%）、Pina-D1a/Pinb-D1p（2.59%）、Pina-D1b/Pinb-D1a（5.96%）、Pina-D1b/Pinb-D1b（6.74%）和Pina-D1b/Pinb-D1p（0.52%）。Pins对春小麦品种品质性状的影响：Pina-D1a的籽粒蛋白含量、灰分含量、白度、湿面筋含量、Zeleny沉淀值均显著高于Pina-D1b;籽粒硬度、黄度（b^*值）、面筋指数、峰值时间、8分钟面积、稀懈值均显著低于Pina-D1b。与其他等位变异相比,Pinb-D1a的白度、湿面筋含量,Pinb-D1b的出粉率、黄度（b^*值）,Pinb-D1p的籽粒硬度、面筋指数均最高且达显著差异水平。与其他基因型组合相比,Pina-D1a/Pinb-D1a的白度,Pina-D1a/Pinb-D1p的籽粒硬度、面筋指数、8分钟面积,Pina-D1b/Pinb-D1b 的淀粉稀懈值,Pina-D1b/Pinb-D1p的籽粒蛋白含量、出粉率、面粉的湿面筋含量均最高且达显著差异水平。Pins对新疆拉面加工品质的影响：Pina-D1a的拉面手感、粘弹性、总分极显著低于Pina-D1b;Pina-D1b/Pinb-D1p的拉面手感最好,Pina-D1a/Pinb-D1p、Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1b/Pinb-D1b的粘弹性最高;Pina-D1b/Pinb-D1a、Pina-D1b/Pinb-D1b的总分最高。【结论】Pina突变会使新疆春小麦胚乳质地变硬、主要品质性状显著升高,促进新疆拉面的拉面手感和粘弹性等性状得到显著改善,最终促使新疆拉面的加工品质（总分）显著提升;Pinb变异对新疆拉面加工品质的影响不显著。Pina-D1b/Pinb-D1a、Pina-D1b/Pinb-D1b是优质新疆拉面小麦品种品质改良中重点选择的基因型组合类型。     

年龄、温度、膘情对伊犁马卵泡发育的影响

【目的】 研究新疆昭苏地区伊犁马发情周期内卵泡发育变化规律,分析年龄、温度、膘情对伊犁马母马卵泡发育的影响,为掌握伊犁马母马卵泡发育规律提供理论依据。【方法】 选取伊犁哈萨克自治州昭苏县康苏马业配种站内,同一草场放牧情况下84匹母马作为研究对象监测发情期内卵泡发育,分析对比不同年龄、温度、膘情对伊犁马卵泡发育时长的差异性。【结果】 年龄Ⅱ组TF3-F5显著高于年龄Ⅲ组(P＜0.05)。年龄Ⅱ组TF4-5显著高于年龄Ⅲ组(P＜0.05)。平均高温对TF1-F2具有显著影响(P＜0.05),平均高温Ⅰ组TF1-F2显著高于平均高温Ⅱ组(P＜0.05)。平均低温对TF1-F2具有极显著影响(P＜0.01),平均低温Ⅰ组TF1-F2极显著高于平均低温Ⅱ组(P＜0.01)。积温对TF1-F2具有显著影响(P＜0.05),积温Ⅱ组TF1-F2极显著高于积温Ⅰ组(P＜0.01)。膘情对TF1-F2、TF3-F4、TF1-F5、TF2-F5、TF3-F5均具有极显著影响(P＜0.01),对TF2-F3具有显著影响(P＜0.05)。膘情Ⅰ组TF1-F2极显著高于膘情Ⅲ组(P＜0.01)。膘情Ⅰ组TF2-F3显著高于膘情Ⅲ组(P＜0.05)。膘情Ⅲ组TF3-F4极显著低于膘情Ⅰ组(P＜0.01),膘情Ⅲ组TF3-F4显著低于膘情Ⅰ组、膘情Ⅱ组(P＜0.05)。膘情Ⅰ组TF1-F5极显著高于膘情Ⅱ组、膘情Ⅲ组(P＜0.01),膘情Ⅱ组TF1-F5显著高于膘情Ⅲ组(P＜0.05)。膘情Ⅰ组TF2-F5极显著高于第Ⅲ组(P＜0.01),膘情Ⅰ组TF2-F5显著高于膘情Ⅱ组、膘情Ⅲ组(P＜0.05)。【结论】 年龄、温度、膘情均一定程度的影响伊犁马母马的卵泡发育,其中膘情对卵泡发育有极显著影响,体况较差可抑制母马卵泡发育。     

独行菜抗冷相关基因的克隆及表达分析

【目的】独行菜在种子萌发和幼苗生长阶段可耐受一定程度的低温胁迫,研究独行菜的低温耐受机制。【方法】设计兼并引物,从独行菜冷诱导叶片的cDNA中克隆获得LaCBF3和LaCOR15a基因核心片段。利用半定量RT-PCR法分析两个基因在不同胁迫处理下的表达情况。【结果】获得442 bp LaCBF3及405 bp LaCOR15a核心片段,经比对与拟南芥CBF3、COR15a基因核心片段相似性分别为84.38%、81.8%。半定量RT-PCR结果显示在独行菜幼苗中,LaCOR15a基因不仅响应低温胁迫,还能迅速响应高盐、干旱及ABA处理,不同条件下表达各有差异。LaCBF3仅对低温胁迫响应迅速。【结论】LaCBF3、LaCOR15a在独行菜幼苗响应低温胁迫的分子机制中具有重要的调控作用,且LaCOR15a基因也应答干旱、高盐等非生物胁迫。     

N-乙酰半胱氨酸对双酚A诱导的猪肾细胞凋亡和炎症反应的抑制作用

【背景】双酚A(BPA)广泛应用于塑料材料工业制造,其从塑料制品中渗出,暴露在食物、水、土壤和空气等多种环境介质中,导致动物长期接触,并经过胎盘和母乳传递给后代,干扰动物生长和发育,对动物生长性能和生产效率产生不利影响。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为公认的强效抗氧化剂,能够调节氧化应激、细胞凋亡、炎症等多种病理生理过程。然而,NAC对BPA诱导的猪肾细胞损伤的调节作用尚不清楚。【目的】探究抗氧化剂NAC在BPA诱导的PK15细胞凋亡和炎症反应中的潜在作用,为NAC在对抗BPA诱导的猪肾细胞损伤中的应用研究提供科学依据。【方法】选取PK15细胞为试验材料,采用相应的抗氧化检测试剂盒分别测定细胞内过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性变化;设置不同浓度NAC(0、2、5和10 mmol·L-1)预处理,并与BPA共处理PK15细胞,CCK-8检测细胞活力以筛选最佳的NAC作用浓度;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测凋亡相关基因（BAX、BCL-2和Caspase3）表达和炎症相关基因（IL-8、IL-6、IL-1β和TNF-α）m...     

不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪合成相关基因转录表达的影响

【目的】诱导3T3-L1细胞分化为3T3-L1脂肪细胞,研究不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪合成相关基因转录表达的影响。【方法】利用三联诱导法将3T3-L1细胞经诱导分化为3T3-L1脂肪细胞。当3T3-L1脂肪细胞密集后分别采用0(对照组)、0.2、0.5、1 μmol/L生物素处理,分别在12 h、24 h与48 h时检测细胞上清液中PK mRNA、GLUT-4 mRNA、FAS mRNA及ACC1 mRNA相对表达量。【结果】在试验12 h时:各试验组GLUT-4、PK、ACC1 mRNA相对表达量均极显著(P＜0.01)高于对照组,1 μmol/L组与0.5 μmol/L组FAS mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于对照组与0.2 μmol/L组;在试验24 h时:1 μmol/L组GLUT-4 mRNA与PK mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组,1 μmol/L组ACC1 mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于对照组,0.2 μmol/L组与0.5 μmol/L组ACC1 mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组;在试验48 h时:1 μmol/L组GLUT-4 mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组,1 μmol/L 组PK mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于对照组,0.5 μmol/L组FAS mRNA相对表达量极显著(P＜0.05)高于1 μmol/L组,1 μmol/L组FAS mRNA相对表达量显著(P＜0.05)高于对照组,1 μmol/L组ACC1 mRNA相对表达量极显著(P＜0.01)高于其它组。【结论】生物素的添加可以提升脂肪细胞GLUT-4、PK、FAS与ACC1 mRNA相对表达量,且当以1 μmol/L浓度作用时对GLUT-4、PK与ACC1提升效果最佳,以0.5 μmol/L浓度作用时对FAS提升效果最佳。     

干扰KISS1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响

【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E₂）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E₂的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。