玉米大斑病菌Septin基因家族的鉴定与表达模式分析

【背景】隔膜蛋白Septin广泛存在于除植物以外所有真核生物中,是高度保守的GTP结合蛋白家族,被认为是继微管、微丝和中间纤维之后的第4种细胞骨架蛋白。病原真菌的Septin蛋白参与细胞极性的确定、形态塑造及与致病相关的形态转换。【目的】鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Septin基因家族,并进一步分析其在不同发育时期的表达模式,为明确隔膜蛋白Septin与真菌侵染结构发育之间的关系打下基础。【方法】以玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)中6个Septin蛋白的氨基酸序列为探针,在玉米大斑病菌数据库在线Blastp比对和关键词搜索,获得大斑病菌的候选Septin,对其基因结构、理化性质以及跨膜区结构等方面进行生物信息学分析。收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技术系统分析Septin基因家族在玉米大斑病菌侵染结构形成不同阶段的转录水平。【结果】获得了玉米大斑病菌6个候选Sep...     

玉米大斑病菌蛋白激酶C基因的克隆及表达规律分析

 【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息学分析表明,PKC全长DNA序列为3 837 bp、cDNA序列为3 516 bp。由7个外显子和6个内含子组成,编码产物包含1 171个氨基酸残基。在1 380 bp的上游侧翼序列中包含CAAT-box及TATA-box,并且存在热激转录因子(HSF)结合元件和SP1、AP1等结合元件。PKC在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在。半定量RT-PCR结果表明：在以蔗糖为碳源时PKC表达量高于其它碳源,铵态氮为氮源时PKC的表达明显受到抑制。重金属离子Mn2+、Cu2+、Zn2+显著抑制PKC表达。在高渗胁迫环境中下,山梨醇抑制PKC表达,且抑制程度与浓度成正相关;而高浓度NaCl造成高渗胁迫时,PKC由低浓度NaCl时的低丰度表达状态中被激活,表达量迅速增加。【结论】玉米大斑病菌PKC及其启动子的成功克隆与该基因的表达规律丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

玉米大斑病菌培养与DNA提取方法

采用液体静置和振荡两种培养方法进行菌丝培养,以不同省份的玉米大斑病菌为材料,优化CTAB法提取玉米大斑病菌DNA。提取后的DNA经紫外分光光度计在260nm和280nm测定及0.4%琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,液体培养皿法培养菌丝快速、高效,提取DNA的质量好、纯度高。     

玉米大斑病菌的RAPD分析Ⅰ.应用CTAB法提取玉米大斑病菌DNA

用采自河北、辽宁、黑龙江、山东、吉林等５省的１４个玉米大斑病菌菌株为试材进行液体培养，然后采用ＣＴＡＢ法从菌丝中提取ＤＮＡ，通过７５２型紫外光栅分光光度计检测，最后将所提取的ＤＮＡ在热循仪ＰＥ－４８００上进行随机引物多态性扩增。结果发现，所提取的ＤＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值介于１．７３０－１．８４７之间，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到了较清晰的扩增图谱，从而证明了采用的ＣＴＡ法是提取玉米大斑病菌ＤＮＡ并用于分子生物学研究的一种行之有效的玉米。     

玉米大斑病菌生理小种鉴定续报

70年代国内对玉米大斑病菌生理小种鉴定结果表明:全国只有1号小种。80年代初辽宁省丹东市农科所报道:在辽宁省丹东地区存在2号小种。80年代末,试验鉴定结果:吉林省(6个地区)、黑龙江省(哈尔滨)、河北省(保定)、山东省(烟台)出现2号小种,本文是1988年、1989年两年鉴定结果。     

玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法的建立与应用

【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01...     

玉米大斑病菌Velvet基因家族生物信息学分析

采用生物信息学方法对玉米大斑病菌Velvet基因家族成员进行序列鉴定,并从理化性质、保守结构域、二级及三级结构以及功能域等方面进行预测和分析。结果表明,该家族各成员无信号肽结构。玉米大斑病菌Velvet家族基因与其他植物病原真菌Velvet家族基因具有较高同源性。该家族成员具有典型的Velvet超家族保守结构域。二级结构分析结果显示,该家族各成员蛋白质的结构元件均主要由无规则卷曲构成。家族成员可能通过可逆磷酸化在植物病原真菌的次生代谢中发挥作用。上述结果为进一步研究Velvet基因家族在植物病原真菌次生代谢中的作用打下了基础。     

玉米大斑病菌原生质体的制备

以玉米大斑病菌(Exserohilum turcium)菌株9948N为供试菌株，进行了原生质体制备条件的研究。主要探讨了酶、渗透压稳定剂、温度、时间等条件对原生质体产出率的影响。结果表明玉米大斑病菌原生质体制备的适宜条件是：28℃下以10mg／mL纤维素酶 10mg／mL蜗牛酶的混合酶处理经过研磨的菌体，酶解72h，以0．8mol/L甘露醇做渗透压稳定剂。     

玉米大斑病菌有性态研究进展

玉米大斑病是一种严重的叶枯型病害,主要为害玉米叶片、叶鞘和苞叶。该病的病原分为无性态和有性态,有性态学名为Setosphaeria turcica,称玉米大斑刚毛座腔菌,属于异宗配合子囊菌。在自然界中尚未发现有性态的存在,但在实验室中可以诱导有性态的发生。在有性繁殖过程中,会发生遗传物质的重组,产生的杂交后代会出现新的致病小种或者扩大寄主范围。回顾了玉米大斑病菌有性态研究的历史,介绍了交配型鉴定的传统方法,并且得到了用分子生物学方法进行研究的最新结果。     

玉米大斑病菌转录因子StSte12的活性及其对酵母生长的功能互补分析

【目的】分析玉米大斑病菌StSte12的结构、转录活性及功能。【方法】利用生物信息学方法,对获得的StSte12进行保守结构域和进化树分析,推测该基因的功能;利用β-半乳糖苷酶法检测StSte12的转录活性;将StSTE12转化至酿酒酵母ScSTE12基因缺失突变体ste12Δ中,筛选酿酒酵母ScSTE12的功能互补突变体并对其分析,验证玉米大斑病菌StSTE12的功能。【结果】通过蛋白比对发现StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12具有转录激活活性;酵母互补试验表明,StSTE12可以回复酿酒酵母ste12Δ的功能,能够调控酵母细胞的生长。【结论】玉米大斑病菌StSTE12属于STE12-like基因;转录因子StSte12具有转录活性;对酵母细胞在YPD培养基上的侵入生长有重要的调控作用。     

玉米大斑病菌小柱孢酮脱水酶StSCD家族鉴定及其功能分析

【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族,并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响,为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据,获得StSCD基因家族的全序列,并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对;收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,获得不同时期、不同StSCD的表达量,从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因;使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌,测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等,确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD,其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性,StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现,在附着胞时期4个StSCD表达量均上调,其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著,附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降,并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后,黑色素合成受阻,附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD,推测StSCD4参与DHN（1,8-间苯二酚）黑色素的合成,并进而影响附着胞膨压积累。     

玉米大斑病菌转录因子StSte12的表达特性分析及其调控基因的筛选

【目的】确定玉米大斑病菌转录因子StSte12在基因组中的位置,分析目的蛋白质StSte12的结构特征;明确StSTE12在病菌不同发育时期的表达情况;筛选可能受StSte12转录因子调控的基因,分析其匹配序列的结构特征,并比较它们在病菌的中表达情况。【方法】利用生物信息学方法,确定StSte12在玉米大斑病菌基因组中的位置并解析目的蛋白质StSte12的结构特征;利用Western blot技术分析StSTE12在病菌不同发育时期的表达规律;根据酿酒酵母Ste12转录因子的下游调控基因,筛选病菌中可能受StSte12调控的功能基因;并利用生物信息学方法得出下游调控基因的结合位点;利用RT-PCR技术,分析这些基因在StSTE12 RNAi转化子与野生型菌株中的表达情况。【结果】StSTE12的 ID为105656,该基因位于scaffold_13正链的1061747-1064127位置;该蛋白具有Ste12-like蛋白特有的保守结构域（STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构）及空间结构;StSTE12在附着胞时期表达量最大;筛选了部分StSte12调控基因,与StSte12的匹配序列为T\C GAAAC A\G,中间部分GAAAC非常保守;StKAR5在野生型中表达量小于StSTE12 RNAi转化子,StBEM2、StBUD8、StCHS7相反;StRAX2的表达量在野生型和转化子中一致。【结论】StSte12具有Ste12-like所特有的DNA结合结构域和空间结构;该蛋白在附着胞发育中发挥重要功能;筛选了部分StSte12的调控基因,其匹配序列可概括为T\C GAAAC A\G,且证实了这些基因受StSte12调控。     

玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因的克隆与功能分析

【目的】获得玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）cAMP信号转导途径中腺苷酸环化酶基因（StAC）,利用基因敲除技术明确其在病菌致病过程中的功能。【方法】应用简并引物PCR和Genome Walking技术克隆玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因（StAC）DNA全长序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用Southern blotting验证基因拷贝数;通过基因敲除技术创制StAC的缺失突变体,研究玉米大斑病菌cAMP信号转导途径中StAC的功能。【结果】StAC的DNA全长为6 816 bp,由5个外显子和4个内含子组成;ORF为6 018 bp,编码2 005个氨基酸,同源序列比对发现StAC与小麦黄斑叶枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis）的AC基因有96%的同源性;Southern blotting证明StAC在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在;基因功能分析表明,StAC缺失突变菌株Δstac气生菌丝灰白色,不产生分生孢子,毒素活性明显减弱,致病力下降,且在渗透胁迫条件下,菌株的抗逆能力增强,色素合成发生了改变。【结论】StAC主要调控玉米大斑病菌的产孢、致病性、高渗胁迫反应、毒素活性及色素的合成代谢。     

玉米大斑病菌St3HNR基因真核表达载体构建及表达分析

本研究在克隆获得玉米大斑病菌1,3,8-三羟基萘还原酶基因(St3HNR)的基础上,拟对该基因编码产物进行异源表达分析,明确基因功能.试验利用毕赤酵母真核表达系统,构建了玉米大斑病菌St3HNR基因的真核表达载体pPIC9K-St3HNR,采用电击转化法将重组质粒转入表达宿主菌GS115中得到了重组酵母菌株,经甲醇诱导...     

中国2001年玉米大斑病菌生理小种鉴定

利用含不同抗性基因的玉米作为鉴别寄主，对2001年分别采自于河北、辽宁、黑龙江等省的37个玉米大斑病菌菌株进行生理小种鉴定。鉴定结果表明，供试菌株中不仅有0号(原1号)、1号(原2号)小种，还出现了12，23，3N，12N号等其它生理小种。尤其是由于本试验出现了对带Ht抗性基因的玉米均致病的123N号生理小种，这应引起育种工作者的高度注意。     

玉米大斑病菌Homeobox转录因子家族全基因组鉴定及其表达规律分析

【目的】从全基因组水平上鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Homeobox转录因子家族及其分布,阐明该家族的序列及进化特征,分析该家族基因在病菌不同生长发育时期的表达规律。【方法】利用生物信息学手段搜索玉米大斑病菌全基因组数据库,鉴定Homeobox转录因子家族;采用MEGA 5.0软件进行系统进化树分析;利用在线工具GSDS(gene structure display server)(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图;利用Clustal X 1.83软件分析Homeobox保守结构域(HOX保守结构域)的氨基酸序列特征;利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)对Homeobox蛋白的二级结构进行在线预测;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析Homeobox转录因子家族在病菌不同发育时期的表达模式。【结果】在玉米大斑病菌中鉴定了8个Homeobox转录因子家族成员(St HTF1-8),根据基因结构及系统进化特征将其分为4类;亚细胞定位预测分析表明,这8个蛋白全部定位在细胞核中;该家族成员均含有HOX保守结构域,其二级结构具有特征性的"螺旋-转角-螺旋"(helix-turn-helix)结构;利用q RT-PCR技术对该家族成员在菌丝、分生孢子形成、芽管形成、附着胞及侵入丝形成等5个时期的表达规律分析,发现不同基因在病菌不同发育时期具有不同的表达水平,其中St HTF1在菌丝发育、分生孢子及附着胞形成等3个时期的表达水平相对较高,St HTF3、St HTF4在分生孢子形成时期表达水平最高,St HTF6在芽管形成时期的表达水平最高,St HTF2、St HTF5、St HTF7和St HTF8在附着胞形成时期的表达水平均较高。【结论】玉米大斑病菌包括Homeobox转录因子家族包含8个成员,在进化上分为4大类,全部成员均分布在细胞核内,其编码蛋白质均含有保守的HOX结构域及"螺旋-转角-螺旋"空间结构;该基因家族成员在病菌不同发育时期呈现不同的表达规律。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS功能分析

[目的]利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能.[方法]将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSi lent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2.利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异.[结果]本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅.对转化子进行半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS表达量均有所下降;黑色素产量显著降低;菌丝呈不规则状,发生了膨大、变形、分枝等现象.[结论]StPES在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生.