氧酰基载体蛋白还原酶基因FgOAR1对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响

【背景】禾谷镰孢(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病(Fusarium head blight)的主要病原真菌,侵染后导致作物品质和产量下降,同时产生多种真菌毒素,严重危害粮食生产和人类健康。氧酰基载体蛋白还原酶(3-oxoacyl ACP reductase,OAR1)催化羧酰基载体蛋白还原成氧酰基载体蛋白,在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。【目的】构建FgOAR1基因缺失突变体,研究其表型、显微结构、孢子产量、有性生殖和致病力等的变化,探究FgOAR1的生物学功能,揭示其对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响,为新型抑菌作用靶点的筛选及小麦赤霉病的防控提供科学依据。【方法】以禾谷镰孢野生型菌株PH-1为材料,应用Split-Marker基因敲除技术,构建FgOAR1基因缺失突变体(ΔFgOAR1),Gap-repair技术获得缺失基因的回补突变体(ΔFgOAR1-C);将PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株分别接种到常规培养基,观察菌落表型变化并测定脂肪酸含量差异;接种到含刚果红(Congo-Red)、SDS、NaCl和H₂O...     

抗、感多菌灵的禾谷镰孢菌菌株间产孢竞争模型的建立

用单独和混合培养的方法研究了在营养贫乏的条件下禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株No.2458和敏感菌株No.2021间产孢竞争的作用.结果表明:在单独培养时,抗性菌株No.2458产孢前期和后期分别呈抛物线方式消长,敏感菌株No.2021前期呈直线方式,后期呈抛物线方式消长;敏感和抗性菌株在等量接种混合培养条件下,其前后期产孢模型分别为N∑s=-1.43×105+2.64×104T-46.09T2和N∑r=-2.99×103+6.45×102T-1.13T2.在混合培养时No.2021产孢高峰与其在单独培养时的相同,而No.2458的产孢高峰比其在单独培养时提前24 h,并且前者在培养42.5～190 h处于竞争优势,后者在190～474.5 h处于竞争优势,抗、感菌株间产孢量表现拮抗作用.     

禾谷镰孢菌对氰烯菌酯敏感性基线的建立

采用菌丝生长速率法测定了氰烯菌酯(2-氰基-3-氨基-3-苯基内烯酸乙酯JS399-19)对上海郊区禾谷镰孢菌(Fusarium gramineatum)分离菌的有效中浓度(EC50),并由此建立该药剂的敏感性基线。氰烯菌酯对上述分离菌均具有很强的抑制作用,其EC50值的范围在0.098 0~0.504 1μg/mL之间,平均值为0.258 9±0.055 1μg/mL;其敏感基线呈单锋曲线,接近正态分布。各分离菌株之间对该杀菌剂的敏感性差异较小,且并不因用药年份不同而有明显的差异。氰烯菌酯对禾谷镰孢菌的多菌灵敏感型菌株和抗药型菌株也均具有极强的抑制作用。这表明该药剂在发生多菌灵抗药性的地区可以大面积推广应用,以减少赤霉病的发生。本研究结果对于今后监测上海郊区禾谷镰孢菌群体对氰烯菌酯敏感性的动态变化,制定该药剂合理使用策略具有重要的指导意义。     

抗、感多菌灵的禾谷镰孢菌菌株间产孢竞争模型的建立

用单独和混合培养的方法研究了在营养贫乏的条件下禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株No.2458和敏感菌株No.2021间产孢竞争的作用。结果表明:在单独培养时,抗性菌株No.2458产孢前期和后期分别呈抛物线方式消长,敏感菌株No.2021前期呈直线方式,后期呈抛物线方式消长;敏感和抗性菌株在等量接种混合培养条件下,其前后期产孢模型分别为N∑s=-1.43×105 2.64×104T-46.09T2和N∑r=-2.99×103 6.45×102T-1.13T2。在混合培养时No.2021产孢高峰与其在单独培养时的相同,而No.2458的产孢高峰比其在单独培养时提前24h,并且前者在培养42.5～190h处于竞争优势,后者在190～474.5h处于竞争优势,抗、感菌株间产孢量表现拮抗作用。     

多菌灵、硫磺及其不同配比对禾谷镰孢菌的毒力测定

以多菌灵、硫磺原粉按照不同的比例进行混配,在室内对禾谷镰孢菌（Fusarium graminearumSchw）进行毒力测定。结果表明,不同比例混配的多硫混剂对禾谷镰孢菌菌丝生长速率有明显的抑制作用,各配比与单体多菌灵和硫磺相比有显著增效作用。在多菌灵和硫磺之比分别为12．5：12．5、15：10和10：15的3种混剂中,对禾谷镰孢菌的共毒系数分别为118．2、106．5和98．2;3种混剂对禾谷镰孢菌的Ec50值分别为3749、3565和5389μg．L-1,单体多菌灵和单体硫磺的EC50值分别为2415和26800Iμg．L-1;试验证明,25％的多菌灵和硫磺混剂（12．5：12．5）的共毒系数最大,增效虽明显,为最佳配比。     

禾谷镰孢复合种毒素化学型及遗传多样性分析

【目的】明确不同省（自治区）引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种（Fusarium graminearum species complex,FGSC）的毒素化学型和它们之间的遗传差异以及亲缘关系。【方法】选用根据基因Tri13和Tri3序列设计的特异性引物分析来自11个省（自治区）的92株禾谷镰孢复合种菌株的毒素化学型;从100条哥伦比亚大学（UBC）开发的通用引物中筛选出13 条扩增条带丰富、重复性好、信号强、背景清晰的引物,利用筛选出的引物对供试菌株进行ISSR-PCR扩增,使用Popgen32软件计算多态性位点百分率、Shannon’s多样性指数、群体间的遗传距离和遗传相似性;依据Nei’s 遗传距离,利用NTsys2.10e软件进行UPGMA聚类分析,并构建供试菌株的聚类图。【结果】供试的92株禾谷镰孢复合种菌株的产毒素化学型有4种：DON、15-ADON、DON+15-ADON和NIV+15-ADON。其中产生DON和15-ADON的菌株分别为1株和20株;同时产生15-ADON和NIV的有1株;同时产生15-ADON和DON的有55株。筛选出的13条引物对所有供试菌株进行PCR扩增,共获得102条带,其中多态性条带101条,多态性比率为99.02%,平均每条引物产生条带为7.85条。在群体平均水平上,基因多样性指数（H）为0.3129,Shannon’s的信息指数（I）为0.4774,表明禾谷镰孢复合种存在较高的遗传多样性水平;不同地理种群间,各群体的遗传多样性水平具有一定差异,河北、山西、黑龙江和吉林种群遗传多样性最高,安徽和河南种群最低。地理种群间的基因分化系数（Gst）为0.2722,说明不同地理种群间存在一定的遗传变异,但大部分遗传变异（72.78%）发生在种群内。遗传分化系数估算的基因流值Nm=1.3372（＞1）,表明不同地理种群间存在一定的基因流动;遗传关系结果表明河北、山西、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和甘肃菌株群体间亲缘关系较近,山东、江苏、河南和安徽菌株间亲缘关系较近,安徽和内蒙古菌株间的亲缘关系最远。聚类分析显示所有菌株相似系数为0.43-0.95。在相似系数为0.43时,所有菌株分成2大类群,Group 1包括4株北方春播区菌株（吉林、山西和河北张家口）,不产生NIV和DON;Group 2由余下的88株菌株构成,产生的毒素类型主要为DON和15-ADON,其来源于北方春播区（山西、黑龙江、吉林、辽宁、甘肃和河北张家口、唐山）和黄淮海夏播区（河北石家庄、河南、山东、江苏和安徽）,在相似系数为0.664时,各类群分成不同的亚群,亚群的结果与菌株来源有一定的相关性。聚类分析结果和毒素化学型分析显示,同一地理种群的菌株多数聚在一起,个别菌株分散到不同的分支上。【结论】北方春播区和黄淮海夏播区的禾谷镰孢复合种主要的毒素化学型为DON和15-ADON。引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种菌株群体内存在丰富的遗传变异,不同地理种群间存在一定的基因交流,遗传多样性与地理来源有关。     

自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病

【背景】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程,调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染,但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用,解析假禾谷镰孢致病机理,为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列,利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒,经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子,并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体（ΔFpAtg3）。构建pKNTG-FpAtg3重组载体,导入ΔFpAtg3菌株,利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录,以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态;PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率;CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态;皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的...     

禾谷镰孢菌对戊唑醇敏感基线的建立和不同杀菌剂的交互抗性

为了明确禾谷镰孢菌对三唑类杀菌剂戊唑醇的敏感性及该药剂与其他杀菌剂的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定了河南、山东和河北等不同地区的120个禾谷镰孢菌单孢菌株对戊唑醇的敏感性,同时测定了10株敏感菌株对异菌脲、福美双、百菌清、苯醚甲环唑和多菌灵的交互抗药性。结果表明:戊唑醇对禾谷镰孢菌的菌丝生长具有明显的抑制作用,EC50范围为0.007 2～0.200 7μg/mL,最大值与最小值相差27.875倍,平均值为(0.102 6±0.045 4)μg/mL,其敏感性频率呈近似正态分布,可作为禾谷镰孢菌对戊唑醇的相对敏感性基线。戊唑醇与上述不同作用机制杀菌剂之间相关系数低,均无交互抗性。     

禾谷镰孢菌β2-微管蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

【目的】在大肠杆菌中表达禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）的β2-微管蛋白,筛选使β2-微管蛋白可溶性表达的诱导因子,并对可溶性蛋白进行纯化。【方法】以构建好的质粒（pET32a+-β2-tubulin）为模板,PCR扩增出β2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,并转化到表达宿主菌BL21(DE3)及Rossatta（DE3）pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达,并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子;对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证。【结果】获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆;为了克服常规诱导条件下表达的β2-微管蛋白主要以包涵体形式存在的问题,通过对诱导温度、时间、诱导物浓度、初始诱导时的菌液浓度、培养液及宿主菌等六因子的综合分析,获得了β2-微管蛋白可溶性表达的优化条件;利用HisTrap HP预装柱对β2-微管蛋白进行纯化,可获得纯度很高的可溶性β2-微管蛋白;SDS-PAGE确认表达出的融合蛋白分子量为51.6 kD;Western blot证实表达的融合蛋白能与6×His及β-微管蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。【结论】本研究为外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达提供了参考;获得的微管蛋白为研究微管蛋白靶标类药物的抗性机制以及生产中开发新的以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。     

小麦赤霉病禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)产碱性蛋白酶的发酵条件

小麦赤霉病是全球毁灭性作物病害之一。禾谷镰刀菌产生碱性蛋白酶与侵染麦粒有关,纯化碱性蛋白酶对研究真菌降解谷物蛋白有重要作用。本研究探讨了培养基及发酵条件对禾谷镰刀菌菌株F15产碱性蛋白酶的影响。试验结果表明,优化的禾谷镰刀菌产碱性蛋白酶的液体发酵条件为:培养基含葡萄糖3.000%、蛋白胨2.000%、麸皮2.500%、KH2PO40.100%、KC l 0.200%、ZnSO40.001%、CaC l20.001%;培养条件为:初始pH9、接种量8%、种龄60 h,在120 r/m in下28℃振荡培养84 h,碱性蛋白酶活力达534.2 U/m l。     

几种粉剂配方对小麦赤霉病菌的毒力和田间防效

测定表明，１＃配方和治萎灵ＳＬ的抑菌效果相近，ＥＣ５０值分别为１．２５ｍｇ·ｋｇ－１和１．１２ｍｇ·ｋｇ－１。在开花初期进行田间喷洒６２５ｍｇ·ｋｇ－１有效成份的药液，１＃、２＃配方和治萎灵ＳＬ的田间防效分别达８３．４３％、８２．２７％和８３．０８％，高于３＃配方的７２．４６％和多菌灵ＷＰ的６６．７０％，１＃、２＃配方显示出替代治萎灵ＳＬ和其它药剂在生产上应用的潜力。     

宁夏小麦赤霉病禾谷镰刀菌致病性分化的研究

将宁夏小麦赤霉病禾谷镰刀菌单饱分离的纯培养菌系10个有效菌株,分别接种在12个小麦品种和宁夏主栽小麦品种永良4号上,结果表明,禾谷镰刀菌系间存在较明显的致病性分化现象,对于不同品种其致病力不同,菌系和小麦品种间均表现出不同的反应。将宁夏小麦赤霉病禾谷镰刀菌的70个单孢纯培养菌株接种在宁夏主栽品种永良4号上,结果显示中致病力菌株占41.4%,弱致病力菌株占40%,强致病力菌株占18.6%。     

禾谷镰刀菌的酯酶和酸性磷酸酯酶同功酶电泳分析

对来自不同小麦栽培区的38个禾谷镰刀菌菌株进行了酯酶、酸性磷酸酯酶的电泳分析，结果表明，禾谷镰刀菌具有3条标墀性酯酶带，根据其变化特点，供试菌株的酯酶同功酶谱可划分为5种类型，其中类型1为主体型，占总测菌株数的76.3%；其它类型为少数型，分别占总测菌株数的10.5%，2.6%，5.2%；类型5为新出现的谱型，禾谷镰刀菌具有2条标志性酸性磷酸酯酶酶带，以其出现与否划分为供试禾谷镰刀菌菌株为2种酶谱类型，分别占供试菌株总数的36.8%与63.2%。     

小麦赤霉菌FGSG_03700基因敲除及功能研究

[目的]敲除小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)FGSG_03700基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。[方法]应用Split Marker基因敲除技术,构建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒,通过PEG介导,进行原生质体转化,在含有潮霉素的培养基上筛选转化子。[结果]通过PCR正负筛查,得到3个确定的突变体,分别命名为ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。通过表型验证及孢子对番茄侵染试验发现,敲除突变体的菌落形态及生长速度没有明显变化,致病力没有减弱,但突变体的产孢量低于野生型PH-1。[结论]FGSG_03700基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关。     

东北赤霉病菌对杀菌剂敏感性及其应用的研究

采用室内生物测定法对东北小麦赤霉病菌 11个菌株对杀菌剂的敏感性进行了测定。结果发现 :田间菌株对多菌灵的耐药性普遍增强 ,达 4倍以上 ;禾谷镰孢菌的子囊孢子和分生孢子对杀菌剂抵抗能力强于菌丝体。毒力测定和田间药效试验表明 :有效地防治赤霉病必须选择对子囊孢子和分生孢子毒力强的杀菌剂 ,多·代混剂和克百菌是目前防治赤霉病较好的杀菌剂     

稻瘟病菌与禾谷镰刀菌对茭白的致病性及侵染过程

稻瘟病菌与禾谷镰刀菌均是危害禾本科作物的重要病菌,同时也是研究植物病原真菌的两种模式生物。为进一步探索这两种病菌的致病能力和侵染过程,对稻瘟病菌与禾谷镰刀菌在茭白上的致病能力进行了测定,并比较了二者在茭白不同部位的发病过程及特点。结果显示,稻瘟病菌可侵染茭白叶片与叶鞘,但无法侵染茭白的肉质茎（茭白笋）;而禾谷镰刀菌不能侵染未创伤的茭白叶片和叶鞘,但可对茭白笋造成危害。对侵染部位的显微观察发现,稻瘟病菌在茭白叶片上能形成典型的附着胞与侵染菌丝。另外,茭白能有效地区分两种病菌的致病突变体。结果表明,稻瘟病菌与禾谷镰刀菌能够侵染茭白,造成危害;同时茭白也可以作为寄主研究这两种病菌的致病过程。     

多菌灵、多抗霉素及其复配对小麦赤霉病菌的生物活性研究

[目的]筛选多菌灵和多抗霉素对小麦赤霉病菌菌丝生长抑制效果最好的复配比例。[方法]在室内选用95%多菌灵和10%多抗霉素化学药剂进行复配,计算单剂和混剂对小麦赤霉病菌丝生长的抑制率、毒力曲线及其EC50值,研究其对小麦赤霉病菌复配效果,并选用共毒系数法来确定两种药剂的最佳混配比例。[结果]95%多菌灵和10%多抗霉素对Y73#菌菌丝生长的有效抑制中浓度EC50值分别为6.6和0.7μg/ml,表明四川省雅安生态区小麦赤霉病致病菌Y73#菌对多抗霉素比较敏感,而对多菌灵已经产生了抗药性;95%多菌灵和10%多抗霉素混配后表现出加相或增效作用,混剂中多菌灵含量为20%时,共毒系数最大,CTC值为243.5,表现出较强的增效作用。[结论]多菌灵和多抗霉素的最佳复配比例为1∶4。