气肿疽NanA基因真核表达质粒的构建与鉴定

为构建气肿疽NanA基因真核表达质粒,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了1对特异性引物,以气肿疽梭菌基因组DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,将连接后的pMD 18-T-NanA进行鉴定分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达质粒连接。结果表明:构建的重组克隆质粒pMD 18-T-NanA和重组表达质粒pVAX1-NanA经PCR鉴定和酶切鉴定正确。该试验成功构建了气肿疽NanA基因真核表达质粒,为气肿疽核酸疫苗的制备奠定了基础。     

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。     

银狐生长激素成熟mRNA真核表达载体的构建

用PCR方法，从含有银狐生长激素mRNA的阳性重组质粒pMD18-T-IGH中亚克隆出生长激素基因，然后定向插入到真核表达载体pcDNA3．1( )中，通过酶切、质粒PCR和序列测定对质粒进行鉴定表明，成功构建了银狐生长激素成熟mRNA真核表达质粒pcDNA3．1-IGH．     

山羊痘病毒P32基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,用特异性引物扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,连接于pMD18-T载体,转化到JM109感受态细胞,对重组质粒双酶切、PCR鉴定与序列分析得出:P32结构蛋白基因全长969 bp,编码323个氨基酸.与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因序列同源性分别达99%和97%;与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因编码的氨基酸同源性分别达98.9%和96%.     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析

设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD 18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-TK.再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%～100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性.     

甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立

根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defeBSin基因的哺乳动物细胞真核表达栽体.把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defeBSin,并将其转化到大肠杆菌里.最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定.结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序.结果也完全一致.所以,重组质粒per3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成.且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同.     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

环形泰勒虫suAT1基因的克隆及序列分析

以环形泰勒虫兰州株基因组为模板,经PCR扩增获得了suATI的部分基因,将该基因克隆到pMD20-T载体,对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定及序列测定.结果表明:该基因的长度为1 377bp,编码了459个氨基酸.同源性分析结果显示:克隆序列与CenBank收录的环形泰勒虫参考核苷酸序列同源性为98.35%,氨基酸同源性...     

C型口蹄疫病毒VPI基因的克隆及真核表达载体的构建

应用PT-PCR扩增C型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体中,并对克隆载体和VP1基因进行序列分析。将VP1基因和选择标记基因——二氢叶酸还原酶（dhfr）基因插入真核表达载体pCI-neo中,对所构建的重组真核表达载体进行PCR扩增、酶切鉴定和序列分析。结果表明,VP1基因与GenBank中标准毒株（登录号EU553893）VP1的序列同源性为92.8%,VP1基因的真核表达载体pCI-VP1-D构建成功。     

牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

p E G F P - N 3 - L P L重组真核表达载体的构建及在V e r o细胞中的表达

目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础.     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

bcl-2/EGFP融合基因真核表达质粒的构建

为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。     

牛白细胞介素-18基因原核表达载体的构建

根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

新孢子虫与弓形虫交叉抗原基因AMA1的克隆及原核表达载体构建

为了解新孢子虫与弓形虫交叉抗原基因AMA1的生物学特性,应用PCR技术扩增新孢子虫/弓形虫AMA1基因,将PCR产物纯化回收后克隆于pMD18-T Simple Vector,构建pMD18-T-Nc/Tg AMA1重组克隆质粒,经PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析后,亚克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-Nc/Tg AMA1,经PCR鉴定、酶切鉴定表明,构建的原核表达载体正确。该试验为新孢子虫/弓形虫AMA1基因重组疫苗的研究奠定了基础。     

绵羊角蛋白中间丝基因KIF1.2的克隆及序列分析

为了分析南疆地方品种羊和田羊毛囊角蛋白中间丝KIFI.2基因,以和田羊为实验动物,从绵阳毛囊中提取总RNA,利用反转录获得的cDNA第一链为模板,通过PCR扩增KIF1.2基因,插入pMD18-T克隆载体中经限制性内切酶双酶切和PCR检测双重鉴定并测定序列.结果,扩增出序列长度为1215 bp的基因片段,测序结果与GenBank上已公布的序列同源性为99％.该实验研究将为进一步通过基因和蛋白的调节来改良南疆地方品种羊和田羊羊毛品质提供必要的理论依据.