H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和TaqMan探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验.结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×103 copies/mL;...     

H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速、简便检测H3N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据H3和N2亚型AIV HA、NA基因保守序列,分别设计筛选了特异性引物和用不同荧光基团标记的TaqMan探针。通过优化反应条件,建立了H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示该法特异性强,不与其他亚型AIV和常见禽病病原体发生交叉反应,敏感性达100拷贝/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于3%;应用该法对96份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。表明本研究建立的H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于H3N2亚型AIV的快速诊断和监测。     

H3N8亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立简便、快速检测H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,本研究根据H3和N8亚型AIV的HA和NA基因保守序列,设计合成了2对特异性引物和2条Taq Man探针,通过优化反应条件建立了H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR。结果表明:该方法敏感型好,对H3N8亚型AIV检测敏感性达100个模板拷贝数。该方法特异性强,仅对H3和N8亚型AIV检测为阳性;应用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。因此,本研究建立的H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法具有简便、快速、敏感和特异等优点,可为H3N8亚型AIV感染的有效防控提供技术支撑。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型,因而对其进行病毒的监测与诊断显得极其重要。通过比对GenBank上H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了一个特异性针对H9 AIV HA的探针。特异性和扩增曲线实验结果显示,该探针具有较好的扩增效率,且仅特异性识别H9亚型AIV。通过重组质粒pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。实验结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法敏感性能达到100个DNA拷贝数,比传统PCR方法检测敏感性提高了1000倍。此外,本方法还能检测到10EID50个病毒,比传统PCR方法检测敏感性也提高了1000倍。通过批间和批内试验,结果表明,这两个试验的变异系数分别小于5%和1%,说明本研究的方法具有较好的重复性。此外,通过检测人工感染动物咽拭子,结果表明H9亚型AIV荧光定量PCR方法比传统PCR的方法检测敏感性提高了100倍。在临床样品的检测中,H9亚型AIV荧光定量PCR方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了大约30%。综上所述,本研究所建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确性和敏感性,对H9亚型禽流感疫情防控及其流行病学调查具有积极的科学意义。     

禽流感病毒H9和N2亚型双重RT-PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据AIV H9亚型和N2亚型基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了H9亚型和N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT-PCR扩增,可得到545bp H9基因特异性条带和341bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。结果表明该双重RT-PCR最低能检出100fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10~(-4) ng/μL(1.30×10~4 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。     

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。     

禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、准确的禽流感病毒N9亚型检测方法,根据GenBank中收录的禽流感病毒N9亚型高度保守的基因序列设计引物,通过优化反应条件建立禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,用该方法检测时,H7N9、H10N9均呈阳性,而非N9亚型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽传染病病毒均呈阴性,能检测到1/32血凝单位的H7N9禽流感病毒。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点,值得推广应用。     

应用荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒

为了解青岛市饲养的家禽是否感染H5亚型禽流感病毒,以制定切合实际的防控措施,2005年1月～2006年9月,对139个养禽场和211个养禽户饲养的家禽采集棉拭子和组织样品,共采集活禽样品27 835份,病死禽样品573份,应用荧光定量RT-PCR技术,进行H5亚型禽流感病毒检测,结果全部为阴性,在分子水平上证明了青岛市无禽流感病毒感染.     

H9亚型禽流感病毒TaqMan MGB荧光RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中发表的H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测H9亚型AIV的荧光RT-PCR方法,利用该方法和商品化试剂盒对临床样本同时进行检测。结果显示,该方法可特异性检测H9亚型AIV,与H3和H5亚型AIV、新城疫病毒、鸭病毒性肠炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合征病毒等主要禽病病毒无交叉反应;该方法检测范围为10-1~10-5个拷贝数,相关系数R2=0.997。对3个不同浓度的RNA进行组间和组内重复性试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于2.0%,具有良好的重复性。用本方法和商品化试剂盒对采集的349份野鸟粪便进行检测,两者具有高度的一致性(K=0.85),本研究建立的方法检测临床样本结果更接近真实值。本研究提供了一种快速、准确、敏感和特异的H9亚型AIV检测方法,可为临床诊断和流行病学调查提供可靠的检测依据。宁夏是中亚野鸟迁徙的主要旅居点,应加强野鸟和家禽群体的疫病监测,做到早发现、早诊断、早处置。     

应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

为了验证荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的可行性,应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原评估检测方法的特异性,检测不同稀释度的H7N9亚型禽流感抗原,并用建立的方法检测采自三鸟批发市场100份泄殖腔、喉拭子。结果是建立的荧光RT-PCR方法,H7体系能检测出1:10-10抗原稀释度,N9体系能检测1:10-9抗原稀释度,对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应;检出100份泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。结果表明,荧光RT-PCR方法H7N9亚型禽流感病毒具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。     

H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H7N9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因和NA基因的保守序列,分别设计特异性引物和不同荧光基团标记的TaqMan探针。通过优化反应条件,建立了H7N9亚型AIV的双重实时荧光定量RTPCR检测方法。结果显示,该法检测H7N9亚型AIV的下限为102copies/μL,批内重复和批间重复变异系数均小于3%。本研究建立的H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR方法,具有快速、特异和敏感的优点,可为H7N9亚型AIV的有效防控提供技术支撑。     

荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒方法的建立与验证

根据H5亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以H5亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品绘制标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.995,灵敏度约为8拷贝/μL,相当于8个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为H5亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、低成本、高通量、生物安全性好的定量检测方法。对178份临床泄殖腔棉拭子样品的检测,该方法结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%,在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示了良好的应用前景。     

H9N2亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立

根据H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因的保守序列,设计2套特异性LAMP引物和2条探针引物,同时在2条探针的5′端分别标记不同的荧光基团,在3′端都标记猝灭基团,然后使用多色荧光成像仪观察反应后是否有荧光产生来判断反应管里是否有阳性扩增,通过荧光颜色的不同来分析阳性扩增产物的类型。特异性试验结果显示该方法能特异性扩增H9亚型和N2亚型AIV,对其他15个HA亚型和其余8个NA亚型AIV以及禽类常见病原体均无扩增;干扰性试验结果显示H9和N2两种亚型AIV可以在同一反应管中独立完成扩增,二者互不干扰;敏感性试验显示其最低检测限度为100拷贝/μL。试验结果表明本试验建立的二重荧光RT-LAMP检测方法具备反应快速、灵敏、特异性强同时可以用肉眼直接观察辨别扩增产物的优点,对H9N2亚型AIV临床快速检测具有较好的应用前景。     

H9N2亚型禽流感病毒原位杂交检测方法的建立

根据已知禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)核蛋白(NP)基因序列，选取其中保守区域设计出1时引物。以RT-PR方法扩增出543bp的NP基因片段，采用地高辛标记制备探针。MDCK细胞人工感染H9N2亚型禽流感病毒后，不同时间取样制备细胞涂片，进行原位杂交，研究了禽流感病毒时MDCK细胞的感染。探讨了原位杂交的条件及其应用于检测AIV感染的可行性。结果显示，感染24h后，原位杂交可检测出细胞内的病毒RNA，并且杂交信号的强度与感染时间的长短有关。研究表明。原位杂交检测禽流感病毒，不但能很好地表现病毒和细胞的位置关系,而且具有较好的特异性和灵敏性，为禽流感病毒的组织原位杂交检测奠定了实验基础。     

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法.该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL.本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑.     

H3N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种简便、快速检测H3N2亚型禽流感病毒的方法,试验根据Gen Bank中H3、N2亚型禽流感病毒HA和NA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件建立H3N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法。结果表明:该方法既能同时特异性扩增出H3N2亚型禽流感病毒,也可扩增出H3、N2亚型禽流感病毒,而对其他亚型和常见禽病病原体均不扩增;该方法对H3N2亚型禽流感病毒的检测下限为10 pg;用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。说明试验所建立的H3N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。