牛ARRDC3和ARRDC4基因的克隆和生物信息学分析

旨在对克隆的牛ARRDC3和ARRDC4基因特性进行分析。以人ARRDC3和ARRDC4基因序列作探针,BLAST获得牛的表达序列标签(ESTs)序列,并设计引物利用RT-PCR方法从牛肩胛骨肌肉克隆c DNA序列,填充牛表达序列标签序列间的空缺,得到牛ARRDC3和ARRDC4基因。序列分析表明,牛ARRDC3基因编码区长1 245 bp,编码414个氨基酸;牛ARRDC4基因编码区长1 242 bp,编码413个氨基酸。氨基酸分析表明,ARRDC3蛋白主要分布在细胞质,不属于分泌蛋白;其磷酸化位点分布于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构预测以无规则卷曲为主;保守结构域预测含一Arrestin_C功能结构域。ARRDC4蛋白主要分布在细胞质和微体,不属于分泌蛋白;其磷酸化位点分布于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构以无规则卷曲为主;保守结构域预测含两段低复杂度序列和一Arrestin_C功能结构域。     

牛MARK2、CREB5基因的克隆和生物信息学分析

试验旨在对牛MARK2、CREB5基因进行克隆和生物信息学分析.首先在GenBank数据库中利用人MARK2和CREB5基因序列比对获得牛的表达序列标签(ESTs)的序列,进行引物设计并利用RT-PCR方法从牛肩胛骨肌肉中克隆出MARK2和CREB5基因的cDNA序列,补足空缺部分,最终获得牛MARK2和CREB5基因.通过对牛MARK2和CREB5基因的生物学特性进行分析可知:牛MARK2基因的编码区长为2 076 bp,编码691个氨基酸,CREB5基因的编码区长1 527 bp,编码508个氨基酸;经蛋白质理化性质预测MARK2和CREB5蛋白均为亲水性蛋白;MARK2和CREB5蛋白的磷酸化位点均分布于苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)残基上;MARK2蛋白与CREB5蛋白的二级结构预测以无规则卷曲为主;亚细胞定位预测MARK2蛋白主要分布在细胞质中,CREB5蛋白主要分布在细胞核中,两者均不属于分泌型蛋白;MARK2蛋白保守结构域预测含1个S_TKc和1个UBA功能结构域,CREB5蛋白保守结构域预测含有1个ZnF_C2H2、1个BRLZ功能结构域和5个低复杂度区域且二者均不具有跨膜结构.     

牛GUCY1A3和SFXN1基因的克隆及生物信息学分析

试验以人GUCY1A3和SFXN1基因序列为探针,BLAST获得同源性较高的牛的表达序列标签（ESTs）序列及部分mRNA序列。通过RT-PCR方法从牛肌肉及脑组织克隆cDNA序列与牛表达序列标签进行拼接,获得牛GUCY1A3和SFXN1基因,并对其进行了生物学特性分析。序列分析表明,牛GUCY1A3基因编码区长2 076 bp,编码691个氨基酸;牛SFXN1基因编码区长969 bp,编码322个氨基酸。氨基酸序列分析表明,GUCY1A3蛋白磷酸化位点分布于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上,主要分布在细胞质中,不属于分泌蛋白,二级结构预测以α螺旋为主,保守结构域含1个CYCc功能结构域;SFXN1蛋白磷酸化位点分布于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上,主要分布在内质网和浆膜上,属于跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,保守结构域含1段低复杂度序列和3段跨膜螺旋区。试验结果为进一步研究牛GUCY1A3和SFXN1基因的表达调控机制与功能奠定了基础。     

牛Myf5基因克隆及蛋白质生物学特性分析

本试验旨在扩增牛Myf5基因,并对其蛋白质生物学特性进行分析。根据GenBank中已公布的牛Myf5基因序列设计1对引物,利用RT-PCR方法从牛背腰最长肌组织扩增牛Myf5基因,连接PUCm-T载体,进行酶切和测序鉴定,同时利用在线工具对牛Myf5蛋白的基本性质、二级结构和磷酸化位点进行预测。获得的牛Myf5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸。蛋白质生物学特性分析结果表明,Myf5具有该家族基因典型的碱性螺旋—环—螺旋结构域,氨基酸组成上丝氨酸(Ser)含量最高,其磷酸化位点分别位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系.结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％、99.79％,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变(T→T→C),导致第38位氨基酸发生变化(V→V→A).牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节.     

京海黄鸡肌细胞生成素基因的克隆和生物信息学分析

本试验根据GenBank中公布的原鸡肌细胞生成素（myogenin,MyoG）基因序列设计1对引物,采用RT-PCR方法,从京海黄鸡肌肉组织中克隆MyoG基因的编码区序列,并使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析MyoG 基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因编码蛋白的二级结构和三级结构。最终获得了包括编码区在内的长754 bp的MyoG基因序列,生物信息学分析显示,京海黄鸡MyoG基因的保守性较低,与GenBank中原鸡、火鸡、鹌鹑、马、人、野猪、牛、山羊、大鼠、绵羊的同源性分别为99.7％、94.4％、92.0％、70.0％、70.0％、73.3％、69.0％、67.9％、67.8％、73.5％;氨基酸分析发现,MyoG蛋白为水溶性蛋白,分子质量为25854 u,理论等电点为5.46,不属于跨膜蛋白;亚细胞定位显示,大部分蛋白位于细胞质内,不属于分泌蛋白;预测含有6个潜在的磷酸化位点,1段碱性序列,1段HLH序列,1段低复杂度序列;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示MyoG蛋白的结构域呈螺旋状。     

青海高原牦牛PRDM1基因克隆及生物信息学与差异表达分析

以青海高原牦牛淋巴结,90日龄胎儿头部皮肤,牦牛精子以及西门塔尔牛精子为材料,通过RT-PCR克隆了包含PRDM1基因编码区的cDNA序列。将克隆获得的青海高原牦牛PRDM1基因的cDNA与黄牛相应序列进行比对,对青海高原牦牛PRDM1蛋白与其他物种PRDM1蛋白进行序列比对和进化树分析,对青海高原牦牛PRDM1蛋白的特性和结构进行预测。荧光定量检测青海高原牦牛淋巴结,90日龄胎儿头部皮肤,牦牛精子以及西门塔尔牛精子中PRDM1基因mRNA表达量。结果显示,克隆获得青海高原牦牛PRDM1基因该部分cDNA片段长度为761bp,其中PRDM1基因编码区长741bp,编码246个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与黄牛该序列存在3个碱基的变异;青海高原牦牛PRDM1蛋白与黄牛、野牦牛、绵羊、马相应序列同源性分别是99.0%,99.0%,97.0%,92.0%;各物种PRDM1蛋白进化树符合物种进化规律。包含卷曲螺旋等典型结构域,人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白1具有94%的相似性,人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白10具有36%的相似性,具有SET结构域活性。青海高原牦牛PRDM1基因在西门塔尔、牦牛精子中表达量极显著高于青海高原牦牛淋巴结(P<0.05),90日龄胎儿头部皮肤中表达量极显著低于青海高原牦牛淋巴结(P<0.01)。从青海高原牦牛克隆获得PRDM1基因编码区揭示了其分子特征,为青海高原牦牛PRDM1蛋白质功能的研究奠定基础。     

贵州黑山羊独立生长因子1B基因cDNA克隆与生物信息学分析

选择与羊同源性较高的牛独立生长因子1B(GFI1B)基因序列设计特异性引物,提取贵州黑山羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对GFI1B基因进行克隆测序及序列分析。结果表明:首次克隆了贵州黑山羊GFI1B基因cDNA序列996 bp,GenBank登录号为JN662390,编码331个氨基酸。贵州黑山羊GFI1B基因与牛的同源性高达97.0%。聚类分析显示:哺乳动物、禽类和两栖类各为一类。生物信息学分析表明:山羊GFI1B分子包括1个低组分复杂性区域、6个锌指结构域ZnF-C4。同时,预测结果还表明GFI1B分子不包含信号肽序列且没有跨膜螺旋结构域,26个磷酸化位点,蛋白糖基化位点有7个。     

延边黄牛ASB12基因的序列分析及组织表达分析

为了分析ASB12基因在牛生长发育中的作用,试验以延边黄牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆ASB12基因的编码区序列及部分基因组序列,利用生物信息学方法对ASB12基因进行分析,同时采用半定量方法检测ASB12基因在不同组织的表达情况。结果表明:所克隆的牛ASB12基因编码区序列长度为1 055 bp,部分基因组序列长度为1 598 bp(Gen Bank登录号为HQ608159),包含1个内含子。生物信息学分析显示,该蛋白可能存在3个N-糖基化位点,3个豆蔻酰化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点;存在1个保守的结构域,与蛋白ANK具有较高的同源性。组织表达谱分析显示,牛ASB12基因在肌肉等多种组织中均有表达。     

柞蚕核型多角体病毒ptp-1、ptp-2基因序列比较及转录分析

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyinucleopoly hedrovirus,ApNPV)是柞蚕脓病病原,有关ApNPV的分子生物学研究可为病害综合防治提供理论依据。对ApNPVptp-1、ptp-2基因序列特性进行计算机辅助分析,并就其转录特性进行RT-PCR分析。结果表明:ApNPVptp-1、ptp-2基因均具有早期基因序列特性,但在柞蚕蛹体内这2个基因分别于感染后72、96 h开始转录,属于杆状病毒晚期基因家族。只有部分鳞翅目杆状病毒编码ptp-1、ptp-2基因同源区,非鳞翅目杆状病毒不编码ptp-1、ptp-2基因同源区,而ApNPV为鳞翅目杆状病毒,同时编码ptp-1、ptp-2基因同源区。PTP-1、PTP-2蛋白氨基酸序列中均含有双特异性蛋白磷酸酶(DSPc)结构域和酪氨酸特异性蛋白磷酸酶结构域,但在杆状病毒生命周期中,这2个蛋白是否具有相同的功能尚不清楚。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

 克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系。结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%、99.79%,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变（T→T→C）,导致第38位氨基酸发生变化（V→V→A）。牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节。     

水貂AANAT基因克隆及生物信息学分析

【目的】试验旨在对美洲水貂(Neovison vison)褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine, MT)合成的限速酶5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(aralkylamine N-acetyltransferase, AANAT)基因进行克隆和生物信息学分析,为探究AANAT基因在水貂中的生物学功能提供参考。【方法】对水貂尾静脉采血后提取DNA,利用同源重组的方法克隆AANAT基因并分析其编码区(CDS)序列,推导成氨基酸序列后进行相似性比对及系统进化树构建,并对AANAT蛋白进行生物信息学分析。【结果】水貂AANAT基因序列长约1 631 bp, CDS区长504 bp,可编码167个氨基酸。水貂AANAT氨基酸序列与雪貂相似性最高(98.2%),系统进化树分析也显示其与雪貂亲缘关系最近。生物信息学分析结果表明,水貂AANAT蛋白为疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,主要分布于细胞质中,有5个抗原结合位点为非分泌型蛋白,该蛋白含有多个磷酸化、糖基化等翻译后修饰位点。AANAT蛋白含有1个保守的N-酰基转移酶超家族结构域,该家族与哺乳动物的昼夜节律密切相关。AAN...     

三黄鸡ST3Gal6基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对三黄鸡ST3Gal6基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考三黄鸡ST3Gal6基因序列设计引物,采用PCR技术克隆三黄鸡ST3Gal6基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的三黄鸡ST3Gal6基因全长1169 bp,含有1059 bp的完整CDS编码区,编码352个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与人、黑猩猩、牛、大鼠、蟾ST3Gal6基因对应序列的同源性分别为62%、62%、61.9%、59%、54.4%。组织表达谱分析表明,ST3Gal6基因在各组织均不同程度地表达,其中在大脑表达量很高,肺脏中最低。生物信息学预测ST3Gal6蛋白结构发现,三黄鸡的ST3Gal6蛋白存在2个跨膜螺旋结构域,同时预测ST3Gal6存在22个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。     

郏县红牛POLB基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆郏县红牛DNA聚合酶β(DNA polymerase beta, POLB)基因,并对其进行生物信息学分析。【方法】以郏县红牛肌肉组织cDNA为模板,通过PCR方法克隆POLB基因完整CDS区序列;利用在线软件进行遗传距离分析并构建系统进化树,分析POLB蛋白的理化性质、疏水性、磷酸化位点、跨膜结构、信号肽、二级结构、三级结构和互作蛋白。【结果】郏县红牛POLB基因CDS区序列全长1 008 bp,编码335个氨基酸。系统进化树分析表明,郏县红牛POLB基因氨基酸序列与绵羊等反刍动物的亲缘关系最近,与其他哺乳类动物和禽类次之,与斑马鱼(鱼类)最远。郏县红牛POLB蛋白分子质量为38.26 ku,理论等电点(pI)为9.10,半衰期为30 h,不稳定系数为31.06,总平均亲水系数为-0.659,属于稳定的亲水性蛋白;磷酸化位点预测分析发现,郏县红牛POLB蛋白包含17个丝氨酸磷酸化位点、12个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;跨膜区和信号肽预测结果显示,郏县红牛POLB蛋白不属于跨膜蛋白和分泌型蛋白;二级结构和三级结构预测发现,其主要包含α-螺旋、β-转角、延伸链和无...     

猪转化生长因子β受体Ⅱ基因克隆与组织表达特征分析

为了研究猪转化生长因子β受体Ⅱ(transforming growth factor beta receptorⅡ,TGFBR2)基因序列特征和组织表达特征,利用克隆测序技术获得二花脸猪TGFBR2基因编码区序列,采用RT-PCR技术分析二花脸猪TGFBR2基因的组织表达特征。结果显示:二花脸猪TGFBR2基因编码区序列长度为1 461 bp,编码蛋白含486个氨基酸残基,含有ec TbetaR2结构域、蛋白激酶结构域等典型的功能域;RT-PCR发现TGFBR2基因在二花脸猪下丘脑、子宫、卵巢和肌肉等12种组织中广泛表达,特别是在卵巢组织中高表达。结果表明:猪TGFBR2基因为进化上相对保守且在卵巢组织中高表达的基因。     

绵羊MC4R基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊MC4R基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛MC4R基因序列设计引物,采用PCR技术克隆绵羊MC4R基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的绵羊MC4R基因全长1 919 bp,含有999 bp的完整CDS编码区,编码332个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与牛、人、猪、大鼠、小鼠MC4R基因对应序列的同源性分别为95.2%、68.8%、82.7%、76.6%、77.1%,预测的氨基酸序列同源性分别为97.0%、92.8%、93.7%、92.2%、91.6%。组织表达谱分析表明MC4R基因在各组织均不同程度的表达,其中在大脑表达量很高,其他组织较低。生物信息学预测MC4R蛋白功能发现,绵羊的MC4R蛋白存在7个跨膜螺旋结构域,同时预测MC4R存在10个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。结果表明,MC4R是一个非常保守的蛋白,在绵羊的生长发育中起着重要作用。     

洋草麦HdCAD基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆洋草麦肉桂醇脱氢酶基因（HdCAD）,揭示HdCAD基因的序列特性,对HdCAD蛋白进行生物信息学分析。[方法]以洋草麦转录组数据中的HdCAD为参考序列,设计1对特异引物,利用RT-PCR技术克隆HdCAD基因;利用生物信息学软件对HdCAD基因序列进行分析,对HdCAD蛋白的理化性质、蛋白结构、亚细胞定位等进行预测和系统进化树分析。[结果]HdCAD基因编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸。HdCAD蛋白含有17个磷酸化位点,不含有跨膜结构域和信号肽位点,预测定位在细胞质中;二级结构中,以无规卷曲元件占比最高;含有1个典型的CAD1结构域,属于MDR超家族。系统进化树分析结果显示,HdCAD蛋白与二粒小麦、节节麦、西藏裸大麦亲缘关系最近。[结论]该试验成功克隆HdCAD基因、预测了该基因编码蛋白的序列特征和功能,可以为今后研究洋草麦抗非生物胁迫功能提供参考。     

山羊PNPLA3基因克隆及序列分析

PNPLA3蛋白属于patatin样磷脂酶家族,能够参与脂肪积累和脂肪动员,且该蛋白与肝脏炎症、肝纤维化密切相关。本研究旨在克隆PNPLA3基因序列并进行生物信息学分析,以简州大耳羊为实验对象,屠宰后,采集皮下脂肪组织,Trizol法提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊PNPLA3基因序列,对所获得的序列进行生物信息学分析。结果显示:克隆得到山羊PNPLA3基因序列1564 bq(GenBank登陆号:MN643056),其中CDS区1344bp,5'UTR234bp,3'UTR49bp,编码447个氨基酸残基;山羊PNPLA3氨基酸序列与绵羊(Ovis aries)、牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的氨基酸序列相似性分别达到83.89%、81.21%、56.38%、56.15%、58.42%;山羊PNPLA3蛋白与绵羊亲缘关系最近,而与原鸡(Gallus gallus)的亲缘关系较远;山羊PNPLA3蛋白为疏水性酸性蛋白,大部分由α螺旋和无规则卷曲构成,分别占比44.07%、39.6%,有18个丝氨酸、3个苏氨酸、3个酪氨酸磷酸化位点,无信号肽剪切位点,有2个跨膜结构域,具有1个PNPLA家族同源结构域,STRING数据库检索到PNLIP、PNPLA2、LIPC、PNLIPRP3等蛋白可能与PNPLA3蛋白存在相互作用关系。本实验成功克隆出山羊PNPLA3基因,为进一步阐明PNPLA3基因在调控山羊脂质代谢中的作用及分子机制提供基础资料。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列(登录号:AF130119.1)设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(61.78%),无规则卷曲次之(20.78%)。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为获得纤维小体(cellulosome)的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列(GenBank登录号:JN109634.1)设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,试验利用1对引物同时成功克隆获得2个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长867 bp,编码288个氨基酸,命名为ScaC2基因;另一个基因全长870 bp,编码289个氨基酸,命名为ScaC7基因。核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因ScaC2与ScaC7的核苷酸序列相似性为74.1%,ScaC2基因与黄色瘤胃球菌AGY80P318及ScaC7基因与黄色瘤胃球菌DA640P037 ScaC基因核苷酸序列相似性均为99%;氨基酸保守序列分析显示,ScaC2和ScaC7氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有1个Ⅰ型黏附域和1个Ⅰ型锚定域。蛋白表达分析显示,ScaC2和ScaC7基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为33 ku。本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因ScaC2和ScaC7可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料。