牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

本研究对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养、诱导分化和鉴定,采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,观察卫星细胞及诱导分化后肌管的形态结构,并利用标志基因的反转录PCR（RT-PCR）和免疫荧光染色方法对分化前后细胞进行鉴定。结果显示,分离出的肌卫星细胞呈梭形生长,生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,纯化后的肌卫星细胞纯度大于93%;诱导分化后,卫星细胞融合生长,形成的肌管状态良好,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究建立了一套从牛肌肉组织中分离和鉴定肌卫星细胞的方法,可以为肌肉的发育分化和肉牛肉质改良研究提供良好的细胞模型。     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

miR-103在牛骨骼肌卫星细胞中的分化调节作用

为了阐明miR-103对牛骨骼肌卫星细胞的分化调节作用,试验将miR-103的过表达载体和miR-103抑制剂分别转染到分离培养的卫星细胞中,利用EDU功能检测试验、Real-time PCR和免疫荧光试验来分析miR-103对卫星细胞增殖和分化的调控作用,并用Western-blot和实时定量PCR检测miR-103对靶基因CCNE1的蛋白和mRNA水平表达情况的影响。结果表明:在牛骨骼肌卫星细胞中,miR-103能促进卫星细胞的分化并抑制细胞的增殖。说明miR-103是牛骨骼肌卫星细胞分化的一种重要的调控因子。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素（MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖（DCN）为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2（si-DCN）转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期（GM）牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天（DM3）的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调（P<0.05;P<0.01）,且EdU阳性细胞率显著增加（P<0.05）,表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,MyHC在mRNA水平显著降低（P<0.05）,但在蛋白水平上极显著升高（P<0.01）,免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组（P<0.05）,说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

猪骨骼肌卫星细胞中miR-24功能的初步研究及靶基因分析

为了探讨miR-24对猪骨骼肌发育的影响,对体外培养1日龄纯种长白公猪骨骼肌卫星细胞分别转染miR-24过表达载体和干扰片段,发现过表达miR-24后,成肌分化基因MyoD、Myogenin和Myf5表达量显著升高,骨骼肌卫星细胞分化趋势增强;干扰miR-24后,Myogenin的表达量显著降低;同时,靶基因预测结果显示Myogenin可能是miR-24的靶基因。     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

miR-1对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

探讨miR-1对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,为改善牛肉品质提供重要的理论基础。首先构建miR-1的过表达载体并进行牛骨骼肌卫星细胞的转染,然后采用Ed U法检测发现miR-1抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖。双荧光素酶报告表明PAX3为miR-1的靶基因。最后检测出miR-1过表达后PAX3在mRNA和蛋白表达水平均下降。试验结果提示:miR-1能够通过抑制PAX3的表达而抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖。     

miR-374b及其靶基因Myf6调控成肌细胞增殖分化的研究

本实验旨在研究miR-374b及其靶基因Myf6调控肌细胞增殖分化的作用机制。首先采集70日龄胎羊,培养成肌细胞并诱导分化成肌管,通过荧光定量PCR测定诱导分化时期(0、24、72、120 h)miR-374b、Myf6基因以及成肌细胞增殖标志基因MyoD和分化标志基因MyoG、MyHC在mRNA水平的表达量;通过转染miR-374b过表达载体(mimics)及抑制载体(inhibitor),研究各基因在细胞中mRNA水平的表达规律;采用蛋白免疫印迹技术检测Myf6基因在细胞中蛋白水平表达变化规律。结果表明:细胞在分化第72、120小时出现大量肌管,诱导分化成功;miR-374b的表达趋势为先上升后下降,细胞增殖标志基因MyoD在细胞增殖期(0 h)表达量较高;分化标志基因MyHC、MyoG及Myf6基因在细胞增殖期表达量较低,进入分化阶段后表达量极显著上调;转染miR-374b过表达载体(mimics)后,miR-374b表达量极显著高于阴性对照组,而Myf6基因、MyHC基因表达量极显著低于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著低于阴性对照组;转染miR-374b抑制载体(inhibitor)后,miR-374b表达量极显著低于阴性对照组,而Myf6、MyHC、MyoD基因表达量极显著高于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著高于阴性对照组;MyoG基因表达量显著低于阴性对照组。上述结果表明,miR-374b可能通过靶向Myf6基因抑制绵羊成肌细胞分化。     

二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

为探究二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响，本研究将体外培养的牛骨骼肌卫星细胞分别用0（对照组）、1、2、4 mmol/L二甲双胍进行处理，采用CCK-8法筛选出二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度，接着通过EdU染色法检测二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后对其增殖的影响，然后对二甲双胍处理的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化，通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的细胞状态，然后利用Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞的分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）、肌细胞生成素（MyoG）在分化24、48和72 h的表达情况。结果表明，二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度为2 mmol/L。2 mmol/L二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后，其细胞增殖率显著降低（P<0.05），说明二甲双胍可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖；牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现减少趋势，牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC、MyoG在分化24、48和72 h的表达均显著低于0 mmol/L （对照）组（P<0.05），说明2 mmol/L二甲双胍能够抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。研究结果表明，二甲双胍可以显著抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。该研究为二甲双胍在肌肉发育调控及肌损伤修复方面的应用提供一定的理论依据。     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P0.05;P0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P<0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

猪ITGB1与mi R-181a靶向关系的验证

实验旨在探讨猪miR-181a与整合素β1(ITGB1)基因mRNA的靶向关系。通过生物信息学预测miR-181a与ITGB1-3'UTR的结合位点,人工合成猪ITGB1-3'UTR及突变型片段连接到双荧光素酶载体(psiCHECK-2)上,构建野生型(psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR)双荧光酶报告载体。培养PK15细胞分别转染miR-181amimics、negativecontrol和psiCHECK-2-WITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR,用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,qRT-PCR检测ITGB1基因mRNA表达水平,Western blot检测ITGB1蛋白表达水平。将含psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR分别与miR-181amimic共转染PK-15细胞。结果表明:psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR组的荧光素酶活性极显著低于其阴性对照组(P0.01);转染miR-181a mimics能极显著下调ITGB1基因mRNA的表达量(P0.01),显著下调ITGB1蛋白表达量(P0.05),而转染miR-181a Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,ITGB1基因mRNA和蛋白表达量差异均不显著(P0.05)。本研究成功构建了猪野生型及突变型ITGB1-3'-UTR双荧光素酶报告质粒,并证实miR-181a与猪ITGB1-3'-UTR存在靶向关系。     

miR-21在鸭胚胎期胸肌发育中的功能研究

旨在通过研究鸭miR-21的分子特征、时空表达模式以及对鸭骨骼肌卫星细胞的增殖与分化的影响,为探索骨骼肌发育机制提供支撑。本研究选取180枚(98±5)g鸭蛋,相同条件孵化。从孵化第11天到第27天每天取3枚鸭蛋(分别表示为:E11、E12、E13……E26、E27),无菌状态下逐只采集鸭胚胸肌样品。E27时另取3只鸭胚逐只采集腿肌、心、肝、肾、肌胃、小肠、腹脂和皮脂。混合酶消化法和差速贴壁法分离和纯化骨骼肌卫星细胞,骨骼肌卫星细胞增殖、分化时期分别过表达和干扰miR-21表达,利用荧光定量、蛋白杂交、EdU检测及流式细胞术等检测miR-21对鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。qRT-PCR结果显示,miR-21的表达随着孵化时间的增加而增加,E19天时到达最高,然后逐渐降低;E27时,miR-21在肝中的表达量最高。在增殖的鸭骨骼肌卫星细胞中过表达miR-21,荧光定量PCR检测CDK2和CyclinD1基因的mRNA表达量分别显著(P<0.05)和极显著增加(P<0.01),EdU检测阳性细胞数目显著增加(P<0.05),流式细胞仪检测发现G2期细胞数目极显著降低(P<0.01)、S期细胞数量显著增加(P<0.05)。在增殖的骨骼肌卫星细胞中,干扰miR-21表达,所得结果相反。在分化的鸭骨骼肌卫星细胞中过表达miR-21,qRT-PCR检测MyoG和MyHC基因的mRNA表达量均极显著增加(P<0.01);蛋白杂交(WB)检测结果显示,MyoG蛋白表达显著增加(P<0.05),MyHC蛋白表达极显著增加(P<0.01)。免疫荧光检测发现,MyHC阳性细胞数和10核以上的肌管数都极显著增加(P<0.01)。在分化的鸭骨骼肌卫星细胞中,干扰miR-21的表达,所得结果相反。结果表明,miR-21具有促进成肌细胞鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的作用。     

bta-miR-1通过调控PAX7参与骨骼肌发育的功能研究

本研究旨在探究牛miR-1(bta-miR-1)参与调控肉牛骨骼肌发育的分子机制。通过采集布莱凯特黑牛和鲁西黄牛的背最长肌进行sRNA建库,筛选与肉牛骨骼肌发育相关的bta-miR-1,采用生物信息学方法鉴定其保守性和预测其靶基因PAX7;为验证bta-miR-1的功能:在成肌细胞中转染bta-miR-1模拟剂/阴性对照(bta-miR-1 mimic/NC)和bta-miR-1抑制剂/阴性对照(bta-miR-1 inhibitor/NC),48 h后用2%马血清诱导观察肌管分化过程,CCK-8检测细胞增殖率,qRT-PCR检测细胞增殖分化标记基因PCNA、CDK2、Myog、Myod1以及靶基因PAX7的表达量。结果表明,转染bta-miR-1mimic促进肌管分化,降低细胞的增殖率(P0.01),抑制靶基因PAX7的表达(P0.01),转染bta-miR-1 inhibitor则抑制肌管分化,增加细胞的增殖率(P0.05),促进靶基因PAX7表达(P0.01);在细胞增殖方面,转染bta-miR-1 mimic降低其标记基因PCNA、CDK2的表达量(P0.01),抑制组则相反;在细胞分化方面,转染bta-miR-1 mimic增加其标记基因Myog、Myod1的表达量(P0.01),抑制组则相反。综上,bta-miR-1可能通过负调控靶基因PAX7促进成肌细胞分化、抑制成肌细胞增殖而参与骨骼肌的发育过程。     

MG132对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为了研究改变泛素化蛋白水平对牛骨骼肌卫星细胞体外增殖与成肌分化的影响,试验利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,采用1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132处理改变牛骨骼肌卫星细胞泛素化蛋白水平,同时设空白对照组和DMSO对照组,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞的密度,利用Western-blot技术检测牛骨骼肌卫星细胞蛋白泛素化水平的变化,综合筛选MG132的最佳处理浓度;然后通过EdU增殖检测法检测MG132对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;最后通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,利用Western-blot技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyHC的表达情况,综合分析MG132对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。结果表明:牛骨骼肌卫星细胞经不同浓度MG132处理后,空白对照组和DMSO对照组之间细胞密度和蛋白泛素化水平没有明显变化,添加MG132后蛋白泛素化水平明显升高,随着添加浓度的增加对牛骨骼肌卫星细胞生长的抑制作用逐渐增强,综合分析选用1.25μmol/L的MG132进行细胞增殖和分化调控研究;经MG132处理后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率显著低于DMSO对照组(P0.05),诱导分化后的牛骨骼肌卫星细胞形成的肌管数量呈增多趋势,成肌分化标志因子MyHC的表达显著高于DMSO对照组(P0.05)。说明MG132可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进牛骨骼肌卫星细胞的分化。     

miR-145-5p靶向IGF1R介导AKT通路抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-145-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),每个处理3个重复,利用qRT-PCR、EdU和CCK-8方法检测增殖相关基因表达量、EdU阳性细胞数和细胞增殖活性;待猪骨骼肌卫星细胞分化后利用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色方法探究分化相关基因mRNA和蛋白水平及肌管形成情况;采用双荧光素酶试验、qRT-PCR和Western blot探究miR-145-5p对下游IGF1R和AKT通路的影响。结果显示,miR-145-5p基因在肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之(P<0.05);随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高(P<0.05)。在猪骨骼肌卫星细胞体外培养过程中,转染miR-145-5p mimi...     

miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响

为了探究miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响,试验通过NCBI和Ensembl数据库分析整合miR-16a的位置及信息,用miR-16a mimics转染牛肌卫星细胞,将牛肌卫星细胞分为试验组(miR-16a mimics)和对照组(NC),采用实时荧光定量PCR扩增、Western-blot检测和EdU细胞增殖试验对转染处理后的牛肌卫星细胞的增殖和分化两个时期进行研究。结果表明：miR-16a位于牛12号染色体的反义链上,并由前体bta-miR-16a的5′端加工生成成熟的miR-16a。在增殖期,与对照组比较,试验组增殖标志因子Pax7 mRNA和其蛋白相对表达量显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01),EdU标记指数显著降低(P<0.05)。在分化期,与对照组比较,试验组分化标志因子MyoG mRNA相对表达量极显著下调(P<0.01)。说明miR-16a对牛肌卫星细胞的增殖和分化均存在抑制作用。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法的建立

为了给牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法及进一步揭示肌肉分化的机理及转基因肉牛的研究提供重要帮助,试验以新生胎牛的骨骼肌为试验材料,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ与胰蛋白酶结合对其进行消化,并通过差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行分离纯化,同时采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western-blot法对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果表明:研究成功获得了大量的牛骨骼肌卫星细胞;该细胞的标志性分子的mRNA及其蛋白表达的纯度在98%以上;细胞生长状态良好,可稳定传至90代并保持旺盛的增殖活力;细胞分化效率高,2%的马血清能够诱导细胞分化使其融合形成多核肌管,数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌管,并可观察到其具有收缩现象。     

肌分化因子 MyoD 的研究进展

肌分化因子MyoD(亦称MyoD1),是生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族四成员(MyoD、MRF5、myoG、MRF4)之一,1987年首次被克隆。MyoD基因不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化,而且能把许多种类型细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞等)转化为成肌细胞,并可促进成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维。在肌肉特异性基因转录调控中起着总开关的作用。MyoD可激活肌肉基因转录,使非肌细胞转变为肌细胞,因骨骼肌细胞和心肌细胞具有基本相同的收缩装置,通过外源MyoD诱导心肌成纤维细胞向骨骼肌细胞转变,从分子水平探讨恢…