重组大肠杆菌pQE30-ChIL-6/JM109的遗传稳定性研究

为研究携带鸡白细胞介素-6(ChIL-6)基因的重组大肠杆菌pQE30-ChIL-6/JM109的遗传稳定性。本文通过菌株传代方法将重组菌株pQE30-ChIL-6/JM109在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中连续传至100代,选取第1、10、20、50、100代菌株为研究对象,分别比较各代次菌株的菌落形态、细菌形态、质粒保有率、生长速度等差异;取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA序列比对;诱导表达各代次菌株,比较其重组ChIL-6蛋白的表达水平及免疫反应性。结果表明,各代次菌株菌落形态、生长速度等方面无明显差异;在传至100代时的质粒保有率为89%;各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱均未改变,未见ChIL-6基因变异;各代次菌株的蛋白电泳图谱、ChIL-6蛋白表达量、ChIL-6蛋白的体外促鸡脾淋巴细胞增殖活性无明显差异。结果提示,重组大肠杆菌pQE30-ChIL-6/JM109具有较好的遗传稳定性。     

布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白DK63-887基因缺失株的构建及鉴定

为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63-887基因缺失株(16MΔDK63-887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63-887基因,获得突变株16MΔDK63-887。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT-qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63-887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MΔDK63-887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT-qPCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。     

副干酪乳杆菌6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因的克隆和超表达

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因在乳酸菌中超表达的影响,本试验根据副干酪乳杆菌的基因序列设计引物,用PCR的方法扩增6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因,将其连接到乳酸菌表达载体pMG36e,并将重组质粒转化到副干酪乳杆菌及乳酸乳球菌中获得重组菌株;对重组菌株表达产物进行蛋白质水平的电泳检测,检测出表达了大约28kD的蛋白;使用山梨醇替代培养基中的葡萄糖,以未转化基因菌株做阴性对照,进行生长曲线的测定,结果表明,转化菌株能够利用在以山梨醇作为碳源的条件下,重组菌株的生长速度和最终菌浓度均优越于对照菌株。本研究通过超表达6-磷酸山梨醇脱氢酶蛋白,对于进一步研究乳酸菌的耐受性具有十分重要的理论基础。     

重组鸡β-防御素在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

将鸡β-防御素(Gal-3)基因片段插入到酵母表达载体pPIC9k,在毕赤酵母GS115中进行表达,并研究了重组Gal-3的诱导、表达规律和抗菌谱。结果发现,重组菌株在接受诱导培养24h后开始有明显的Gal-3表达,诱导72h时达到表达高峰,至少持续表达96h以上。Tricine-SDS PAGE电泳发现,在约6000位置出现预期的蛋白质条带,约占分泌总蛋白的12.6%。证实,重组Gal-3能完全抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、志贺痢疾杆菌、普通变形杆菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌等细菌的生长,其中大肠杆菌和肠炎沙门菌是对重组Gal-3最敏感的菌株。     

atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响

为研究编码ATP合酶α亚基对大肠杆菌生物学特性的影响，本研究利用λ-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1 (WT) atpA基因缺失菌株LCE-1ΔatpA (KO)和基因回补株LCE-1ΔatpA/pBR322-atpA (RS)，并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上，进一步分析atpA基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响，结果显示，在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异，但在M9培养基中生长明显减缓；KO菌株的部分生化特性也发生了变化，对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变，α-葡萄糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力，结果显示atp基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(P<0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力，结果显示atp基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定，结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染...     

应用发酵罐高密度生产日本血吸虫重组蛋白Sj28GST工艺的研究

为了大量表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,本文采用葡萄糖作为碳源,在不同的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时间等培养条件下进行高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,分别用Bradford法和比浊法分析重组蛋白Sj28GST的浓度和重组大肠杆菌的密度.优化应用发酵罐高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时机等培养条件.研究结果表明,在培养温度37℃、种子液接种量7%、溶解氧浓度保持20%以上、pH 7.2左右、用0.7mmol/L IPTG在重组大肠杆菌TB1开始培养后5 h进行诱导,细菌密度明显提高,获得的重组蛋白Sj28GST的表达产量最高,为74.32 mg/L发酵液,菌体密度达到13 OD左右.     

狐源大肠杆菌HtrA基因缺失株的构建及生物学特性

HtrA是一种重要的抗应激蛋白,对细菌抵抗应激条件至关重要。为研究HtrA蛋白在狐源大肠杆菌致病过程中的作用,本研究利用λ-Red同源重组方法构建狐大肠杆菌HtrA基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬细胞吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价,结果表明:与狐源大肠杆菌野生型菌株相比,HtrA基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本研究成功构建狐源大肠杆菌HtrA基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性

根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。     

不同碳源对反硝化细菌生长的影响

细菌的生长速度和碳源有非常密切的关系,研究不同碳源对反硝化细菌生长的影响,以找到适合用于扩大培养菌种的最佳碳源。分别采用葡萄糖、酒石酸钾钠、蔗糖、乙酸和乙醇5种碳源作为唯一碳源,接种反硝化细菌进行对比实验,采用活菌数来反映不同碳源对反硝化细菌生长的影响。结果显示,葡萄糖促进反硝化细菌生长的作用明显优于其余4种碳源。对反硝化细菌进行扩大培养,葡萄糖的效果是比较好的。     

重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基优化和高密度发酵

为提高重组蛋白的生产效率,利用响应面试验设计技术,对表达猪肺炎支原体P46蛋白的重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基进行了优化,确定了培养基各营养成分及其最佳配比。在相同培养条件下,优化培养基比LB培养基的菌体浓度高出一倍。在生物反应器中利用优化培养基发酵培养该重组大肠杆菌,培养物的湿菌重达39.5 g/L。SDS-PAGE电泳结果显示,高密度发酵对重组大肠杆菌DE-pET-P46的rP46的表达和占细胞总蛋白比例均没有明显的改变。     

重组鸡抗菌肽Gallinacin-9的原核表达及其抗菌活性的鉴定

采用RT—PCR方法,从鸡舌组织中扩增到Gallinacin-9（Gal-9）基因,测序表明Gal-9为201bp,其成熟肽由67个氨基酸残基组成。进一步将克隆的Gal-9基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1的EcoR I和Sal I双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX—Gal-9,经序列分析鉴定确证目的基因克隆人载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳表明该基因在大肠杆菌中高水平表达,表达的重组鸡Gab-9融合蛋白相对分子质量约为32ku。重组蛋白占菌体总蛋白的40％。表达的重组鸡Gal-9融合蛋白以包涵体的形式存在。重组蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌BL21（DE3-）株与致病性链球菌CAB株为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组Gal-9蛋白的抗菌活性,结果表明,重组Gal-9对这2种细菌都具有抗菌活性。     

铜绿假单胞菌F_(190-342)-I_(21-83)基因重组鼠伤寒沙门氏杆菌生物学特性研究

为了研究载体菌株Δasd LH430 (pYA3493)携带外源基因的能力,试验采用分子生物学方法构建了携带铜绿假单胞菌的保护性抗原基因F_(190-342)-I_(21-83)(F1I2)的重组表达质粒pYA-F1I2,将其重组到减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌Δasd LH430 (pYA3493)中,成功构建重组菌株Δasd LH430 (p YAF1I2),并研究了重组菌株的遗传稳定性、表型、毒力。结果表明:构建的重组菌株Δasd LH430 (pYAF1I2)能够稳定遗传所携带的F190-342和I21-83基因;重组菌株生长速度略低于亲本菌株,且遗传了亲本菌株的糖利用能力,在碳源利用方面没有改变;与亲本菌株相比,重组菌株毒力略有下降,对动物更加安全。说明重组菌株Δasd LH430 (pYA-F1I2)可作为铜绿假单胞菌-沙门氏杆菌二联疫苗的候选菌株。     

亚MIC庆大霉素下CpxR对鼠伤寒沙门菌生长特性和acrD基因转录的影响

前期研究发现双组分应答调控子CpxR可调控鼠伤寒沙门菌对氨基糖苷类药物的耐药性。为进一步探索其调控机制,本研究测定了无抗生素和亚MIC庆大霉素下,鼠伤寒沙门菌标准株(JS)、过表达株(JS/pcpxR)、磷酸化位点突变过表达株(JS/pcpxR*)分别在不同能量水平的2种基本培养基中的生长曲线;同时采用LacZ报告基因融合试验方法构建3株acrD启动子融合报告菌株(JS/PacrD、JS△cpxR/PacrD、JS△cpxR/pcpxR/PacrD),通过测定其β-半乳糖苷酶活性,分析无抗生素诱导和亚MIC庆大霉素诱导下CpxR对acrD启动子转录活性的影响。结果显示,JS、JS/pcpxR和JS/pcpxR*在M9-0.2%甘油(+亚MIC庆大霉素)培养基中的对数生长期生长速率均低于各自在M9-0.2%甘油培养基中的对数生长期生长速率,JS和JS/pcpxR*在M9-0.2%葡萄糖(+亚MIC庆大霉素)培养基中的对数生长期生长速率也低于各自在M9-0.2%葡萄糖培养基中的对数生长期生长速率,但JS/pcpxR在M9-0.2%葡萄糖(+亚MIC庆大霉素)培养基与在M9-0.2%葡萄糖培养基中的生长速率基本一致;另外,亚MIC庆大霉素诱导下JS△cpxR/pcpxR/PacrD的β-半乳糖苷酶活性高于JS△cpxR/PacrD,差异极显著(P0.01),与JS/PacrD的β-半乳糖苷酶活性水平相当。结果表明,在葡萄糖存在的环境中,CpxR的过表达可提高鼠伤寒沙门菌对庆大霉素的抗性,且CpxR对外排泵acrD转录的促进是其发挥对庆大霉素耐药性调控作用的重要机制。     

狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。     

重组大肠杆菌DH5α生长曲线的测定

为了探讨重组大肠杆菌适宜的培养时间,试验将携带质粒的重组大肠杆菌DH5α单菌落液体培养至OD600值为0.6左右,按一定比例接种于LB液体培养基中进行培养,分别在0,1.5,3,4,6,8,10,12,14,16,18,20小时时取菌液,用分光光度计测定OD600值,以培养时间为横坐标、OD600值为纵坐标作重组菌生长曲线图,同时提取质粒比较不同培养时间质粒量的变化。结果表明:重组大肠杆菌DH5α的生长经历了迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期4个时期,符合细菌生长的规律;重组大肠杆菌生长至平台期时提取质粒的量最多。     

阿洛糖对非利用型单核增生李斯特菌生长影响的研究

为研究单核增生李斯特菌ICDC-LM188对阿洛糖的利用及阿洛糖对该菌株基因表达的影响,本研究利用含有不同碳源的MWB培养基和LB培养基分别进行单核增生李斯特菌在阿洛糖作用下的生长试验,采用RNA测序并进行主要差异表达基因分析。生长试验结果显示阿洛糖可以抑制ICDC-LM188生长。差异表达基因分析结果显示,5个上调表达基因均与已知的阿洛糖代谢相关,14个下调表达基因中部分与丙酮酸代谢相关,而丙酮酸代谢的抑制会影响菌体生长,推断丙酮酸代谢的抑制可能是阿洛糖抑制部分单核增生李斯特菌生长的原因。本研究为优化LAEB培养基提供了方向及对单增李斯特菌的糖代谢相关研究有借鉴意义。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS：：PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中，构建重组布鲁菌M111（pBBRlMCS：：PR-PL-E）。重组菌株在28℃培养，42℃诱导表达裂解酶E，从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线，计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示，成功制备了布鲁菌菌壳，温控裂解质粒pBBRIMCS：：PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100％。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出，细菌表面出现不同程度的皱缩，细胞形态发生变化。结果表明，本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳，初步研究了其基本特性，为下-步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。     

产不耐热肠毒素大肠杆菌减毒突变菌株的毒性和免疫应答评价

为探究表达不耐热肠毒素突变体(mLT)的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)突变菌株黏膜免疫原性以及作为口服疫苗的应用前景,本研究采用细菌平板计数法、电镜观察和药物敏感试验检测了已构建的mLT突变菌株在LB液体培养基和人工胃肠环境下的生长曲线、菌毛生长和对抗生素的耐药性能,结果显示E.coli mLT-S63K、E.coli ...     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

肠膜明串珠菌乳糖及半乳糖代谢差异性研究

在不同碳源的化学限定培养基（chemically defined medium,CDM）和脱脂乳中对8 株肠膜明串珠菌（Leuconstoc mesenteroides）进行培养,测定其生长、产酸及活菌数变化情况。结果表明：各菌株在以乳糖、半乳糖为单一碳源的CDM培养基中的生长情况存在明显差异,菌株LM1、LM2、LM4和LM8在以乳糖为单一碳源的CDM培养基中生长情况良好,菌株LM2、LM3、LM5和LM8在以半乳糖为单一碳源的CDM培养基中活力较强,但生长情况弱于乳糖环境;在脱脂乳环境下,实验菌株的活菌数于发酵初期明显增长,培养8 h后进入稳定期,发酵终点pH值在6.0以上;初步对比各菌株与乳糖、半乳糖代谢相关基因的差异性,基因与表现型的相关性还需结合乳糖水解酶活性及乳糖、半乳糖残留量进一步分析。