猪细小病毒NS1基因的克隆及表达

根据Bergeron等报道的猪细小病毒基因组序列设计引物，在下游引物中引入BglⅡ酶切位点以便于构建表达载体。利用PCR技术扩增得到NS1全基因，将其克隆到pMDl8-T载体中进行序列测定并分析，进而构建重组转移载体pFast-NS1，在DH10Bac大肠杆菌中与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组，获得重组穿梭载体Bacmid—NS1，经脂质体介导转染Sf9细胞后，得到重组杆状病毒(AcNPV-NS1)。SDS—PAGE、West-ern-blotting分析可见大小约为84000的特异性带，表明NS1蛋白在杆状病毒：Bac-To-Bac表达系统中成功地实现了表达。从而为研究其结构与功能创造了条件。     

抗鹅细小病毒NS1蛋白单链抗体的构建、表达及活性初步鉴定

鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)是小鹅瘟(Gosling plague,GP)的病原体,由于其感染雏鹅和雏番鸭且传播快、病死率高,引起国内外学者的广泛重视.     

猪细小病毒NS1基因密码子偏爱性分析

为给猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV）主要非结构蛋白（NS1）基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对PPVNS1基因进行密码子偏爱性分析。结果显示PPVNS1基因的CAI值为0．642,ENC值为39．703,这表明NS1在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第三位核苷酸尤其偏爱A或T;从与PPVNS1基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有26个、人有27个;PPVNS1基因共有71个大肠杆菌稀有密码子,并且还有多个稀有密码子多次串联成簇出现的情况。结果表明酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

水貂细小病毒NS1与VP2蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了比较VP2和NS1两种蛋白的免疫原性,选择免疫原性较好的蛋白进行亚单位疫苗制备。本试验分别扩增了水貂细小病毒(mink enteritis virus,MEV)NS1与VP2基因,连接pET-32a表达载体并进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以His-Bind亲和层析柱纯化目的蛋白,将纯化后的蛋白免疫小鼠,分析目的蛋白的免疫原性。经SDS-PAGE与Western blotting鉴定,表明NS1与VP2蛋白大小分别为83 和67 ku,且均具有生物学活性;免疫小鼠后,目的蛋白NS1和VP2均可诱导小鼠产生抗MEV特异性抗体,且VP2蛋白诱导小鼠产生的抗体滴度要高于NS1蛋白。与NS1蛋白比较,VP2蛋白更适合亚单位疫苗的制备。     

猪细小病毒SH-1株VP2和NS1基因的克隆与原核表达

通过PCR技术,从感染了猪细小病毒的ST细胞中扩增出猪细小病毒的VP2基因和NS1基因,并将其亚克隆至原核表达载体中,分别构建了重组表达载体pET32c/VP2和pET30a/NS1,经IPTG诱导,使pET32c/VP2和pET30a/NS1在受体菌BL21(DE3)中得到高效表达。经Western-blot检测具有生物学活性,为猪细小病毒野毒与疫苗毒的鉴别诊断奠定基础。     

猪细小病毒的分离与鉴定

贵州某猪场发生一起以初产母猪产弱仔、死胎、畸形胎、木乃伊胎为特征的疫病,根据病毒的分离与鉴定,确诊此次疫病为猪细小病毒感染所致。     

猪细小病毒的分离与鉴定

本试验从福建省某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到1 株病毒。病料接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等细胞病变,猪细小病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。根据已发表的细小病毒(PPV) VP2基因的序列设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增531 bp DNA片段。测序结果表明,分离株VP2基因与NCBI公布的NADL-2株的同源性高达99.2％,证实分离的病毒株为猪细小病毒。为进一步开展该病毒致病机理、流行病学、诊断研究与疫苗免疫等奠定了基础。     

猪细小病毒的分离与鉴定

自死胎和胎猪中分离的3株病毒均可在胎猪肾或仔猪肾原代细胞上增殖、继代,并可产生细胞病变;能凝集鸡、豚鼠及小白鼠的红细胞;对乙醚、氯仿不敏惑;耐酸(pH3.0)、耐热。病毒颗粒多呈圆形,无囊摸,直径为20～23nm。这些病毒的特性及形态等均酷似猪细小病毒,而且在血清学上与从日本和美国引进的毒株有共同抗原性,故认为分离的3株病毒均系猪细小病毒。     

猪细小病毒NS1基因的克隆、表达及密码子优化提高表达水平

通过PCR方法从猪细小病毒(PPV)基因组中扩增NS1基因,将其克隆到pcDNA3.1A质粒中,构建成与Myc/His标签融合的NS1真核表达载体。将表达载体转染PK-15细胞使其表达。利用猪偏爱的密码子对NS1全基因进行了密码子优化,通过构建表达载体和转染细胞,检测并比较了密码子优化前后的表达水平。结果显示:扩增的NS1基因与GenBank序列一致,构建的表达载体结构正确;Western blot检测表明,NS1基因能够在PK-15细胞中进行表达,但表达水平很低,有时检测不到,从而严重影响对其的进一步研究;密码子优化后NS1基因的表达水平由优化前的7μg/T25培养瓶增加至32μg/T25培养瓶,是原来的4倍。可见密码子优化可明显提高NS1蛋白在PK-15细胞中的表达,这为下一步研究NS1蛋白的功能提供了有利条件。     

猪细小病毒疫苗株NS1基因克隆及生物信息学分析

为进一步开展猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）NS1蛋白功能研究,根据GenBank登录的PPV参考株NADL-2（登录号：NC001718）的NS1基因序列设计1对特异性引物,采用PCR技术扩增PPV疫苗株NS1基因,将PCR扩增产物克隆入pTA2载体构建重组质粒pTA2-NS1,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的pTA2-NS1质粒含有一个开放阅读框（ORF）,全长1989 bp,共编码662个氨基酸,与GenBank登录的PPV参考株NADL-2、Kresse株的NS1基因的核苷酸同源性分别为99.85%和99.65%,氨基酸同源性分别为99.70%和99.70%。上述结果表明试验成功构建了含有PPV NS1基因的重组质粒pTA2-NS1。应用DNAStar软件及在线ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM、Scansite、PSORTⅡ等生物信息学软件对NS1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示NS1蛋白分子质量为75.7 ku,等电点PI为6.82,是弱酸性蛋白;NS1蛋白不含信号肽序列,无跨膜区,为可溶性蛋白,主要定位于细胞核内,T199、Y309、T338、T512、S631、T635为其潜在磷酸化位点。以上研究为进行PPV NS1蛋白表达,进一步开展NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

细小病毒非结构蛋白NS1作用机制的研究进展

细小病毒编码的非结构蛋白NS1(non-structural protein 1)是一种多功能蛋白,该蛋白质与病毒DNA的复制、基因转录调控、诱导细胞病理变化等密切相关。本文对细小病毒NS1蛋白的基因转录激活功能、磷酸化修饰以及与胞内蛋白的相互作用等研究进展进行综述,为研究家蚕双义病毒(BmBDV)的NS1蛋白作用机制提供参考。     

猪细小病毒NS1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及南充市猪细小病毒感染的血清学调查与分析

为了建立检测猪细小病毒(PPV)野毒抗体的间接ELISA检测方法,并掌握南充市猪细小病毒的感染情况,试验以原核表达的NS1蛋白为包被抗原建立检测PPV野毒抗体的间接ELISA方法,并应用该方法对2017年采集于南充市9个区(县)的1 854份猪血清样品进行检测与分析。结果表明:建立的NS1蛋白间接ELISA方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清和PPV疫苗免疫血清均为阴性,与HI试验的符合率达98.44%。在1 854份血清样品中共检测出PPV阳性样品349份,总阳性感染率达18.82%。其中南充市9个区县均存在PPV的感染,感染率为5.45%～36.79%;规模猪场、散养户和屠宰场的感染率分别为15.04%、26.39%和17.30%;种公猪、种母猪、后备母猪、仔猪和育肥猪的感染率分别为5.88%、24.75%、23.91%、17.38%和19.13%;自繁自养、自繁+引种、自繁+购活体、购活体4种不同繁育方式的感染率分别为13.58%、21.50%、19.77%和21.12%。说明试验成功建立了检测猪细小病毒野毒抗体的间接ELISA检测方法,且南充市养猪场普遍存在猪细小病毒的感染。     

猪细小病毒NS1基因低温诱导表达及间接ELISA方法的建立

利用PCR技术从猪细小病毒的DNA模板中扩增了NS1的基因片段,将PCR产物克隆至pET32c载体,将构建好的重组质粒pET32c-NS1,转入表达宿主茵BL21中,利用低温诱导表达的方法,避免了包涵体的形成.West-ern-blot结果显示,表达产物有良好的生物活性.纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法.抗原最佳包被质量浓度为2.5 mg/L、血清最佳稀释度为1∶200.表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂用于检测PPV,且能很好的区别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪.     

猪细小病毒YK株NS1基因的克隆与序列分析

提取猪细小病毒（PPV）YK株基因组DNA，利用PCR技术扩增得到了NS1基因全序列，将其克隆到pMD 18-T质粒载体并进行了序列测定和分析。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN和NLTR。PPV YK株的NSl基因与其他PPV毒株NADL-2（4973）株、NADL-2（5075）株、NADL-2（5034）株和Kresse株相比，核苷酸同源性分别为98．3％、99．9％、99．9％和99．7％，氨基酸同源性分别为99．7％、99．7％、99．7％和97．7％。结果说明，NS1基因具有高度保守性。     

鹅细小病毒NS1蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本研究克隆了鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)佛山株(Foshan-2009)的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体p ET32a(+),构建重组质粒p ET32a-NS1。经转化,IPTG诱导表达及SDS-PAGE和Western blot分析表明,NS1蛋白得到了表达,并且能与抗GPV的番鸭血清发生特异性反应。通过棋盘法确定NS1蛋白包被量为0.5μg/孔,待检血清1:50稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:10 000倍稀释时ELISA反应条件最佳,并确定阴阳性临界值为0.399。该ELISA方法特异性强,与番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清均无交叉反应;重复性好,批内和批间重复试验的变异系数分别小于5%和10%;检出率高,GPV阳性番鸭血清的检出率为92%。本研究所建立的间接ELISA方法为鹅细小病毒的血清学诊断和流行病学监测奠定了基础。