陆川猪瘦素基因的克隆及序列分析

为了研究广西陆川猪瘦素(Leptin)基因编码区序列(CDS)的组成,并为下一步开展Leptin基因表达与陆川猪优质肉质形成的相关性研究提供科学理论依据,试验以11月龄陆川猪背最长肌总RNA为模板,根据Gen Bank中已公布的猪Leptin基因序列(登录号为GQ268936)设计1对PCR引物,利用RT-PCR方法扩增Leptin基因c DNA序列,扩增得到的目的片段经过纯化、连接p MD 18-T载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并测定序列,应用PMP生物分析软件进行蛋白质二级结构预测分析。结果表明:成功克隆获得陆川猪Leptin基因编码区长504 bp,与Gen Bank公布的巴马小型猪的基因同源性为99.2%,与藏猪的基因同源性为99.0%;陆川猪Leptin基因CDS与其他猪种相比,存在第73位点的T→C,碱基C为陆川猪所特有,导致色氨酸突变为精氨酸。由Leptin基因系统进化树构建结果可知,广西陆川猪与藏猪的遗传距离最近,其次是弓头鲸,最远是小鼠;陆川猪Leptin蛋白质二级结构包含有4个α-螺旋和2个β-折叠。说明Leptin基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的主要候选基因之一。     

陆川猪肌细胞生成素基因的克隆及序列分析

为了获得广西陆川猪肌细胞生成素(MyoG)基因编码区序列(CDS),试验采集11月龄陆川猪背最长肌,提取其总RNA并反转录c DNA,通过RT-PCR方法扩增出MyoG基因CDS,纯化、回收扩增产物,与p MD18-T载体进行连接,并与大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化,将含有重组质粒的菌液送到生物公司测定序列,最后用生物软件进行序列分析。结果表明:成功扩增获得了广西陆川猪MyoG基因CDS长度675 bp,与Gen Bank报道的野猪同源性达到99.9%,与藏猪同源性为99.6%,与五指山猪、延安猪、荣昌猪、梅山猪的同源性为99.6%以上。与其他猪CDS相比较发现,陆川猪MyoG基因CDS第642位点存在T→C,并发现碱基C是其特有的,但是没有导致氨基酸突变。构建MyoG基因系统进化树,与陆川猪遗传距离最近的是藏猪,最远是褐家鼠。陆川猪MyoG蛋白质二级结构包含1个环、2个螺旋。说明猪MyoG基因高度保守,今后在进行陆川猪肌肉生长发育的研究中,可将MyoG基因作为主要候选基因之一。     

陆川猪HSP27基因的克隆与序列分析

为了研究陆川猪HSP27基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR和克隆方法,扩增了HSP27基因的编码区序列,并进行了测序和序列分析及其蛋白质结构预测。结果表明:陆川猪HSP27基因编码区全长624 bp,编码207个氨基酸;与Gen Bank中已发表的猪HSP27基因序列相比,核苷酸有1个位点发生碱基突变,但并未引起相应氨基酸的改变;陆川猪HSP27成熟肽包含α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲;陆川猪HSP27基因与野猪的亲缘关系最近。     

陆川猪PLIN5基因的克隆和序列分析

为了研究陆川猪背最长肌围脂滴蛋白5(PLIN5,Perilipin5)基因的结构和功能,试验对陆川猪PLIN5基因进行RT-PCR扩增,所得产物经转化获得含目的基因的重组质粒pMD19-T-PLIN5,经菌落PCR扩增和测序鉴定正确后利用生物信息学方法对陆川猪PLIN5基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位等进行分析,并探讨了陆川猪与其他物种PLIN5氨基酸序列的进化关系。结果表明:PLIN5基因编码区(CDS)序列长度为1 377 bp,编码458个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PLIN5基因序列中的编码区存在4个碱基差异,均为错义突变;陆川猪PLIN5蛋白不存在信号肽,没有跨膜结构域,不存在N糖基化位点;二级结构中α-螺旋占47.16%,无规则卷曲占43.67%,延伸链占9.17%;陆川猪PLIN5基因在不同物种及进化过程中具有较高的保守性,该基因编码的蛋白符合一般Perilipin超家族的结构特征。     

陆川猪FTO基因的克隆及生物信息学分析

为了获得广西陆川猪肥胖相关基因(FTO)编码区序列(CDS),试验利用基因克隆技术,从陆川猪背最长肌组织中提取总RNA,扩增出FTO基因CDS,并运用Lasergene 7.0、ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@在线蛋白分析系统和SWISS-MODEL在线分析预测系统等分析软件对扩增出的序列进行生物信息学分析。结果表明:通过克隆测序得到的陆川猪FTO基因CDS全长为1 518 bp,与GenBank中公布的乌金猪FTO基因CDS的同源性为99.9%,与苏钟猪FTO基因CDS的同源性为99.6%;陆川猪存在第1 050位点的C→G,碱基G为陆川猪所特有,导致天冬氨酸突变为谷氨酸;通过建立系统进化树发现,陆川猪与乌金猪的遗传距离最近,它们聚为一支;陆川猪FTO氨基酸组成中亮氨酸含量最高,占总氨基酸的比例为11.7%,FTO蛋白具有较强的亲水性;陆川猪FTO蛋白的二级、三级结构预测显示包含α-螺旋、无规则卷曲和延伸链。说明陆川猪FTO基因具有高度的保守性,今后在陆川猪脂肪沉积研究中, FTO基因可作为主要候选基因之一。     

猪PLEl基因启动子克隆及序列分析

通过巢式PCR方法获得猪PI。E1基因5’端上游启动子序列，通过T／A克隆法对PI。E1基因的启动子进行克隆，并对PCR鉴定为阳性的克隆子进行测序，参考人、啮齿类的羧酸酯酶家族的启动子结构，并利用启动子在线分析软件对其进行生物信息学分析。结果成功克隆得到PI。E1基因5’端上游1153bp的调控片段，分析表明该调控区没有CpG岛，也不存在典型的TATA盒结构；有2个转录起始位点分别位于翻译起始密码子ATG上游-39bp和-37bp处，潜在的转录因子结合位点有C／EBP、Spl、USF、CdxA、GATA-X、GATA-1、GATA-2、GATA-3、MZFl、AML-la、SRY、Nkx-2、LyLl、deltaE等。另外还发现了7种基序分别为EGF-1、INTEGRINBETA、CTCKl、ANA—PHYIJATOXIN-1、THIOLASE-3、TUBUI，IN、VWFC-1。研究结果可为进-步揭示PLEl基因转录调控机制提供理论参考。     

荷包猪SLA-DRa基因的克隆及序列分析

为研究中国特色品系荷包猪SLA-DRa基因(又称SLA-DRa-HB),本试验设计引物,RT-PCR扩增3个个体荷包猪SLA-DRa全基因编码区,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,经酶切鉴定后筛选阳性克隆测序,比较分析与其他SLA-DRa等位基因的差异,并绘制分子进化树。结果显示,RT-PCR成功扩增出目的基因条带,大小约800bp。经克隆测序后分析,SLA-DRa-HB基因全长为779bp,编码区为1—759,共编码252个氨基酸。序列对比分析结果显示,SLA-DRa-HB的特征性变异集中在135、159、202位点。而穿膜区和胞浆功能区(203—252)变异位点为206、248。分子进化树分析显示,SLA-DRa-HB自成一系,且与其他等位基因的进化关系较近。本研究成功克隆荷包猪SLA-DRa基因,为进一步研究其功能奠定基础。     

陆川猪PTTG1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆陆川猪PTTG1基因全长CDS序列并对其进行生物信息学分析。利用GenBank公布的猪PTTG1预测序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学软件分析和预测了陆川猪PTTG1基因的理化性质与二级结构。结果表明,陆川猪PTTG1基因全长CDS序列为609 bp,编码202个氨基酸;其核苷酸序列与牛、黑猩猩、人、猕猴、大鼠、小鼠、原鸡和斑马鱼相对应序列同源性分别为90.15%、87.85%、87.52%、87.03%、76.03%、74.38%、55.74%和44.48%;PTTG1基因编码的蛋白无信号肽,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞质中,存在16个磷酸化位点。氨基酸系统进化树分析表明,不同物种PTTG1基因在进化过程中具有高度保守性。本研究成功克隆了陆川猪PTTG1基因,为今后研究PTTG1基因在猪早期胚胎发育过程中的作用奠定理论基础。     

香猪SRY基因的克隆及序列分析

试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T—A互补法克隆到质粒pGEM—T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG—box长237bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82．1％。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。     

猪Lmbr1基因部分cDNA序列的克隆及序列分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆了正常猪和全同胞多趾猪Lmbr1基因部分cDNA序列并进行了序列分析。结果表明,正常猪该序列长1797bp,其中CDS序列1178bp,3’UTR序列619bp。全同胞多趾猪该序列长1069bp,其中CDS序列768bp,3’UTR序列301bp。正常猪与多趾猪Lmbr1基因的CDS序列相似性近77％,而3’UTR序列相似性不足20％。两者的CDS序列在755～768bp间,共发生13个核苷酸突变：G755C、A756T、A757G、T758C、C759A、A760G、C761T、T762G、A763C、G764T、A765G、T767G、T768A。其中,前11个突变属于错义突变,导致相应的氨基酸序列中4个氨基酸发生变化：G突变为A、I突变为A、T突变为V、R突变为L;后2个突变属于无义突变,导致阅读框提前终止。猪Lmbrl基因发生突变能引起SHH的异常表达,这可能是导致猪多趾发生的根本原因。     

陆川猪H-FABP基因克隆与序列分析

为了研究心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因与陆川猪肌内脂肪沉积的相关性,寻找猪脂肪沉积的主要候选基因,试验对陆川猪H-FABP基因进行了克隆与序列分析,参照Gen Bank已经公布的猪H-FABP基因序列(EF619344)设计引物,扩增克隆了陆川猪H-FABP基因的编码区序列,并应用DNAStar、Prot Scale等生物软件对其进行了序列分析和蛋白质二级结构预测。结果表明:陆川猪H-FABP基因编码区全长402 bp,编码133个氨基酸,碱基序列在235位点由A突变为G,并引起相应氨基酸由精氨酸转变为甘氨酸。其与野猪的亲缘关系最近,碱基同源性为99.3%;与人类、绵羊和家牛的碱基同源性也在90%以上。陆川猪H-FABP成熟肽包含有25.56%的α螺旋、12.03%的β转角、25.56%的无规卷曲和36.84%的延长线。说明H-FABP基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的候选基因之一。     

猪趋化因子受体5基因的克隆及序列分析

为了构建猪趋化因子受体5(CCR5)真核表达载体[CCR5-pcDNA3.1(+)],试验采用PCR、TA克隆、DNA重组、酶切等方法进行鉴定。结果表明:试验成功构建了猪CCR5的真核表达载体。     

猪SelS基因启动子区的克隆及序列分析

本研究旨在克隆和分析猪硒蛋白S基因(Selenoprotein S,SelS)启动子序列,并初步探讨潜在转录因子结合位点对其表达的影响.通过SON-PCR技术克隆猪SelS基因启动子序列,利用PromoterScan、Promoter 2.0等在线工具预测其启动子特征,利用细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激PK15细胞,研究NF-kappaB转录因子对猪SelS基因启动子活性的影响.试验获得了猪SelS基因约3kd的启动子序列,部分序列比对发现猪、人、牛和小鼠物种间相似性仅7%～51%.预测猪SelS基因转录起始位点在-398 bp,猪和人SelS基因启动子存在系列保守的转录因子结合位点,包括NF-kappaB、CCAAT box、SP1、USF等,但均未发现典型的TATA box.细胞试验表明,NF-kappaB转录因子可以上调猪SelS基因的表达.结果提示,物种间SelS基因启动子相似性较低,但猪和人SelS基因的转录因子非常保守,LPS诱导试验提示,猪SelS基因表达可能受NF-kappaB转录因子的调控.     

民猪IFN-γ基因的克隆及序列分析

为了获得民猪干扰素-γ(IFN-γ)基因,并对该基因进行序列分析,试验采用RT-PCR技术,根据猪IFN-γ基因设计1对引物,从刀豆素A(ConA)活化的民猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,获得了长度为502 bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明:民猪IFN-γcDNA长度为502 bp,IFN-γ基因的开放阅读框大小为501 bp,编码166个氨基酸,含有2个潜在N-糖基化位点;民猪IFN-γ基因与藏猪、贵州白香猪、成华猪和梅山猪等的同源性为100%。     

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906bp处为同义突变,110和278bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。     

猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析

本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，结果发现3个新的突变位点：319C→T，537C的插入，551A→G。部分突变序列已被GenBank收录，登录号为：AY236997。将突变序列翻译成氨基酸序列后发现，319C→T和551A→G是同义交变。537C的插入是移码突变，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。     

猪肺炎支原体P46基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体J株P46基因序列设计一对引物,扩增得到P46全基因序列,将克隆得到的P46基因片段克隆至pEasy-T载体中进行测定.将SC株P46基因与232株、J株、7448株及168株进行比对,结果表明SC株与这些株同源性分别为99.9%、99.6%、99.2%、99.0%.     

猪Lbx2基因的克隆、序列分析及表达

试验利用PCR扩增猪Lbx2基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,采用半定量RT-PCR分析猪不同组织中Lbx2基因的表达情况。结果显示,Lbx2基因在肝脏、肾脏和脾脏中微弱表达,在肌肉组织中不表达;通过比较不同物种氨基酸序列,结果发现猪Lbx2与牛、猩猩、犬进化关系较近;此外,在猪Lbx2基因组中发现5处突变位点,其中1个缺失突变(缺失11 bp)位于基因启动子区,另外4个单核苷酸突变分别位于第1外显子和内含子中。该试验结果为下一步Lbx2基因的功能研究奠定了基础。     

猪DDX1基因的克隆、序列分析及表达

根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。     

猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析

参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列.序列分析发现,其ORF2全长2 358 bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高,为77.3％～79.4％;在ORF1b和ORF2连接处有一段高度保守的序列,在ORF2 3'端有一段长83 bp非翻译序列及一个含43 bp高度保守的茎环样基序.本试验不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列,也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据.