水貂出血性肺炎、多杀性巴氏杆菌病、肺炎克雷伯杆菌病三联灭活疫苗的制备及其质量评价研究

为评价水貂出血性肺炎、多杀性巴氏杆菌病、肺炎克雷伯杆菌病三联灭活疫苗的质量,本研究对该三联灭活疫苗进行了疫苗的单剂量、单剂量重复和超剂量免疫的安全性试验,最小免疫剂量、免疫期等效力试验以及疫苗保存期试验。结果表明,该三联灭活疫苗对2月龄以上水貂安全,最小免疫保护剂量为0.5 m L(绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯杆菌含量分别为3.0×10~9 cfu/m L、3.0×10~9 cfu/m L和2.5×10~9 cfu/m L),免疫剂量为1.0 m L/只时即可为水貂提供8个月的完全免疫保护,疫苗在2℃~8℃贮藏15个月仍保持原有的免疫保护效率。本研究研制的该三联灭活疫苗使用安全,对受试动物能够提供100%的免疫保护。本研究为水貂出血性肺炎、多杀性巴氏杆菌病和肺炎克雷伯杆菌病的预防和该三联灭活疫苗的正确使用提供了参考依据。     

水貂源肺炎雷伯菌的分离鉴定及致病性测定

[目的]为鉴定引发某养殖场水貂死亡的主要致病菌。[方法]从送检病貂获取的两株优势菌进行形态学和培养特征观察、生化试验、细菌16S-23S rRNA ISR基因的PCR鉴定、药物敏感试验、致病性试验。[结果]16S-23S rRNA ISR基因的PCR序列分析显示两分离株与已知的Kpn相应序列的同源性为99.9%。药物敏感试验表明分离菌株对阿米卡星、头孢曲松、头孢他啶高度敏感。致病性试验表明两菌株对小鼠均有较强的致病性,半数致死量分别为4.9×106cfu/mL、3.1×106cfu/mL。[结论]确诊分离到的两株优势菌是肺炎克雷伯菌,且该菌是导致水貂死亡的主要致病菌。     

河北部分地区狐狸源肺炎克雷伯菌血清型鉴定、毒力基因及致病性检测

为分析河北部分地区狐狸源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的荚膜血清型、毒力基因流行情况及致病性,从河北地区养殖场中采集患病狐狸肺脏、心血、肝脏等病料组织217份,分离得到63株致病性肺炎克雷伯菌。采用PCR法分别检测63株肺炎克雷伯菌荚膜血清型及19种毒力基因;通过人工感染小鼠致病试验验证4株优势血清型流行株的半数致死量(LD_(50))。结果显示,63株肺炎克雷伯菌中23株为K2血清型,7株为K20血清型。63株肺炎克雷伯菌携带13种毒力基因,毒力基因fimH、mrkD、wabG、uge、ybt、ybtA、alls、ompK35等检出率均在58.73%以上,其他毒力基因检测率较低;分离菌株呈现多重毒力基因型,同时携带9种毒力基因的菌株最多,占致病性菌株的33.33%。优势血清型流行株KD1(K20)和KD45(K2)的致病性最强,其LD_(50)分别为3.16×10~5,3.16×10~6 CFU/mL。本研究为该地区肺炎克雷伯菌病的防控提供参考。     

一株猪源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药性、耐药基因的检测

为了确定发病母猪组织是否感染病原菌及调查病原菌耐药情况,试验对发病母猪组织进行细菌分离培养,经过培养观察、生化试验、16S rRNA测序确定分离菌株,对分离菌株进行药敏试验、小鼠致病性试验、耐药基因检测、常见血清型分型及毒力基因检测。结果表明:分离得到一株肺炎克雷伯氏菌。分离菌株的16S rRNA测序结果与NCBI上18株肺炎克雷伯氏菌参考菌株序列同源性均在99%以上。分离菌株接种在血琼脂培养基上会发生α溶血现象,且具有多重耐药性,携带四环素类tet耐药基因,氨基糖苷类aph(3′)-Ia、strA、strB耐药基因,磺胺类sul 1、sul 2耐药基因及超广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药基因blaSHV,与耐药表型结果一致。分离菌株血清型分型为K20型,含有ureA、wabG、uge毒力基因。在小鼠致病性试验中,以浓度为6.15×10~8cfu/mL的菌液进行攻毒,能够使小鼠在22 h内死亡,表明分离菌株对小鼠具有致病性。说明本试验所分离得到的猪源肺炎克雷伯氏菌具有严重的耐药性和强致病性。     

猪、鸡与貂源肠外致病性大肠杆菌群型、耐药性与致病性分析

为检测不同动物源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的耐药及致病性差异,本研究从132份鸡、猪和水貂等动物肠道外组织中分离鉴定大肠杆菌,并对分离菌株进行了16S rRNA基因测序、毒力基因检测、药敏试验、O抗原鉴定、系统进化群分析及动物致病性试验。实验结果显示:分离出53株ExPEC,且至少携带特异性毒力基因pap、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMTII中的两种基因,并携带fimH、ibeA、hlyA、malX、iss、iroN等其它相关毒力基因。53株ExPEC分离株对氯霉素、卡那霉素、头孢噻吩、四环素、多粘菌素B、氨苄青霉素等呈现不同程度的多重耐药性;O抗原主要分布于O1、O2、O8、O11、O38、O78、O120血清型;系统进化群分析结果显示:28株属于A群,19株属于B1群,1株为B2群,5株属于D群。选取20株ExPEC分离菌株按照6×10~6cfu/只对小鼠进行腹腔注射,验证其致病性;并测定ExPEC6、ExPEC42、ExPEC52、ExPEC53菌株对BALB/c小鼠的LD_(50),其结果分别为3.49×10~6cfu/mL、9.49×10~5cfu/mL、9.48×10~6cfu/mL、2.38×10~7cfu/mL。本研究为动物源性ExPEC的预防诊断提供依据,并为下一步研究其致病机理等奠定基础。     

山东省貂源铜绿假单胞菌分离株的血清型和致病性

为了解山东省貂源铜绿假单胞菌(PA)的血清型分布,本研究从部分市县采集的山东77份水貂肺脏病料样品中分离PA,并进行生化鉴定、分子生物学鉴定、血清学鉴定、生长曲线测定和半数致死量(LD_(50))测定。结果显示,共分离获得53株PA,分别属于11个血清型,其中G型27株、B型5株、D型4株。其他血清型分离株较少。其中G、B和D型分离株SD004、SD050、SD052生长性能良好,对小鼠的LD50分别为1.99×10~(10) cfu、2.51×10~(10)cfu、5.62×10~(10)cfu。该研究为水貂出血性肺炎灭活疫苗菌株的选择提供实验依据。     

貂源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

2013~2016年山东省、河北省、黑龙江省、吉林省的部分水貂养殖场发生了严重的出血性肺炎,导致水貂大量死亡,为了客观评估水貂出血性肺炎的危害及为综合防控提供参考依据,试验对423个水貂病例样本进行分离鉴定并且对所分离的细菌进行了形态特征观察、16SrRNA基因测序、血清型鉴定、小鼠毒力试验测定、生化试验鉴定及药敏试验测定。结果表明:423个样本中分离到68株肺炎克雷伯氏菌,其中最为流行的血清型为K2型(35株);并筛选出4株菌株对小鼠有很强毒力性;生化试验结果表明同一血清型的不同菌株之间也存在明显差异;药敏试验结果表明,4株K2型肺炎克雷伯氏菌强毒菌株对氧氟沙星、阿米卡星2种抗生素均为敏感或介于中间;对强力霉素、环丙沙星等8种抗生素均耐药;对诺氟沙星、庆大霉素等4种抗生素均为耐药或介于中间。     

鹅源肺炎克雷伯菌分离鉴定及其致病性分析

为了确证辽宁鹅源肺炎克雷伯菌的致病性,无菌采集鹅肺炎发病病例的肝脾和肺脏,应用细菌分离培养、生化试验以及PCR方法对分离出的细菌进行鉴定,选取所鉴定的代表菌株,应用小鼠和雏鹅进行致病性试验,结果确认分离到2株肺炎克雷伯菌。小鼠致病性试验显示发病率为95%,死亡率为90%,死亡小鼠表现脑实质出血、肝脏坏死有出血点、肺脏充血出血等病理变化。雏鹅致病性试验显示发病率为100%,死亡率为85%,死亡雏鹅表现气管黏膜出血、大叶性肺炎等病理变化。近年来,鹅源肺炎克雷伯菌引起鹅肺炎为主的疾病发病率、致死率越来越高,防治困难。本研究对鹅源肺炎克雷伯菌的致病性进行了分析,为进一步建立鹅源肺炎克雷伯菌病的诊断和防治技术提供了依据。     

貂源肺炎克雷伯菌耐药性、毒力及免疫原性分析

为分析山东地区貂源肺炎克雷伯菌(KPN)分离株的血清型、耐药性、毒力和免疫原性,本研究从临床患有肺炎症状的水貂肺脏组织中采用常规分离培养鉴定方法、16S rRNA PCR方法和分型PCR方法,分离鉴定出10株K2型KPN(QD/Kp1～QD/Kp10),采用109 cfu/mL的QD/Kp8腹腔注射健康易感水貂,进行动...     

河南驻马店地区猪源肺炎克雷伯氏菌分离菌株生物学特性

为了分析驻马店地区猪源肺炎克雷伯氏菌分离菌株生物学特性,从驻马店地区不同养殖场中采集患呼吸道疾病猪肺脏、鼻拭子等病料组织74份中分离得到了43株肺炎克雷伯氏菌。采用人工感染小鼠致病性试验、PCR方法和K-B药敏纸片分别检测49株肺炎克雷伯氏菌的致病性、血清型及耐药性。结果显示,30株肺炎克雷伯氏菌对小鼠具有很强的致病性;43株分离菌株以K5、K20为主要流行血清型,分别占分离菌株的37.2%、27.9%;43株分离菌株对氨苄西林、阿莫西林、大观霉素等7种药物耐药性较高,耐药率在51.2%以上,对其他药物的耐药率在18.6%~234.9%之间,且呈现多重耐药性,耐10、9种药物分离菌株最多,分别占分离菌株的25.6%、27.9%。本试验为该地区猪源肺炎克雷伯氏菌病的防治提供理论基础。     

3种支原体培养基对猪肺炎支原体CJ株培养效果的比较分析

通过猪肺炎支原体CJ株接种3种猪肺炎支原体培养基后的生长活性研究发现,与其他2种培养基相比,接种改良Friis培养基培养2~3 d含菌量可达到1.0×109~10CCU/m L,具有生长迅速、含菌量高的特点,可用于猪肺炎支原体CJ株的培养。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型的致病性及感染小鼠后的组织分布研究

为了解猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型(APP-S5)对小鼠的致病性及感染小鼠后的组织分布情况,本研究通过测定APP-S5的生长曲线、筛选APP-S5感染小鼠的最佳接种途径以及观察不同剂量的APP-S5对小鼠存活的影响之后,选取1.0×10~7 cfu/只的APP-S5经腹腔注射感染小鼠,以阐明APP-S5感染小鼠后的组织分布规律。结果显示,与肌肉注射和滴鼻相比,腹腔注射接种后小鼠出现的临床症状最早,1.5×10~7 cfu/只接种小鼠后可于5 h内全部死亡;腹腔感染小鼠后,仅在4 h时肺脏中APP-S5菌体含量最多,而在感染6 h时及8 h时肺脏中菌体含量降低。本研究表明,APP-S5感染小鼠后,具有组织嗜性,且不同接种途径对小鼠的致死性存在差异,本研究结果为深入研究APP-S5的致病性提供了实验依据。     

猪2型链球菌的分离鉴定及其致病性分析

为了解猪2型链球菌的致病性强弱、生长繁殖特性及耐药性变化,试验通过细菌分离鉴定、生化试验、生长曲线、OD_(600)值与其活菌数相关性曲线、药敏试验、小鼠致病性试验、病理组织学观察等方法对分离得到的猪2型链球菌进行研究。结果表明:病猪体内分离得到的链球菌经鉴定为猪2型链球菌,将其命名为TA01株;TA01株在6～8 h繁殖达到最高峰,8 h后活菌数逐渐下降;活菌数和OD_(600)值的相关性方程为y=24.659x-1.076 1,R~2=0.996 7;TA01株对青霉素、红霉素、氟苯尼考、苯唑西林敏感,对环丙沙星、多黏菌素B、克林霉素耐药;小鼠致病性试验显示,3.6×10~9cfu/只组的10只小鼠在48 h内全部死亡,且死亡小鼠呈急性脓毒败血症病变,通过Reed-Muench公式计算TA01株的LD_(50)为1.137×10~8cfu/只;病理组织学检查可观察到明显的蓝染菌团,且伴有明显的中性粒细胞浸润。说明TA01株为猪2型链球菌强毒株,与我国已分离报道的链球菌菌株相比,TA01株具有毒力强、增殖快的特性。     

产肠毒素大肠杆菌K88诱发BALB/c鼠肠炎模型的建立及评价

为建立BALB/c小鼠感染产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88肠炎模型,本研究分别灌服小鼠浓度为1.0×107cfu/m L、1.0×108cfu/m L和1.0×109 cfu/m L的菌液,连续灌服3 d,对其发病情况和外周血中各细胞因子水平进行检测。结果显示,灌菌后小鼠食欲下降、体重降低,外周血中IL-1α、TNF-α以及髓过氧化物酶(MPO)含量增加,十二指肠病理组织切片显示炎症发生。灌菌期结束后第5 d,小鼠粪便稀软,体重降到最低,所检测的细胞因子含量达到峰值,与对照组差异极显著(p0.05);十二指肠肠黏膜层与肌层间隙增宽、杯状细胞增多、固有层与黏膜层炎性细胞侵润,炎症变化最为明显。本研究建立了BALB/c小鼠感染ETEC K88肠炎模型,于灌菌期结束后第5 d炎症最为严重。此外,接种不同浓度菌液的小鼠炎性因子数量变化差异不显著(p0.05)。     

6株奶牛乳房炎肺炎克雷伯菌的分离、鉴定及生物学特性

为研究陕西关中地区奶牛乳房炎肺炎克雷伯菌的流行情况,从某规模化奶牛场无菌采集乳样53份,进行细菌分离鉴定。通过细菌形态学观察、生化试验以及16S rRNA序列分析,共分离出6株肺炎克雷伯菌,并对其进行药物敏感性、生物被膜形成、random amplified polymorphic DNA(RAPD)分型以及小鼠致病性的试验。生化特性结果表明6株肺炎克雷伯菌对各种糖的分解能力无明显差异。药敏试验结果表明,6株菌均对恩诺沙星、阿米卡星、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、四环素、美罗培南、头孢曲松和头孢他啶敏感,对青霉素和氨苄西林耐药。生物被膜表型检测结果表明,6株菌均可产生生物被膜,其中菌株KP4为中等黏附,其他5株为弱黏附,生物被膜成分中均含有胞外多糖,不含卷曲菌毛和纤维素。RAPD分型结果表明,分离的6株菌株共分3个基因型,其中C型占50.00%(3/6),B型占33.33%(2/6),A型占16.67%(1/6)。小鼠致病性结果表明,分离株对小鼠均具有较强的致病性,被感染小鼠的肝脏、脾脏和肺脏均有不同程度的出血。本试验为防控陕西省内肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎提供依据。     

狐狸源肺炎克雷伯氏菌分离株生物学特征分析

为确定狐狸源肺炎克雷伯氏菌的致病性、耐药性、耐药机制及其生物被膜(BF)形成能力,本研究对分离自病死狐狸的10株肺炎克雷伯氏菌进行形态特征、培养特性、生化试验、16S r RNA鉴定及khe基因鉴定,利用K-B法检测其药敏性,利用PCR方法检测了其耐药基因、荚膜血清型、毒力基因,利用96孔微量板测定BF形成能力并进行了分离菌对小鼠的致病性试验。结果显示,这10株肺炎克雷伯氏菌均对多种常用抗菌药物耐药,均可以引起小鼠发病或死亡,但BF形成能力有明显差异。部分菌株携带floR、mcr-1、TEM等耐药基因和wabG、fimH、uge、rmpA等毒力基因,89F-2、58F-2、60N-1属于K1血清型。本研究结果为狐狸源肺炎克雷伯氏菌病的检测、诊断及防治提供了实验依据。同时,本实验首次从狐狸源肺炎克雷伯氏菌中检测到粘菌素耐药基因mcr-1,这将为黏菌素的临床使用和风险评估提供技术参考。     

水貂肝脏中克雷伯氏菌的鉴定

为了检验辽宁省某水貂场患呼吸系统疾病的散发病例是否由肺炎克雷伯氏菌引起,试验采用病理剖检、组织切片、无菌技术分离细菌、分子生物学鉴定等方法对其进行检验。结果表明:通过对患病水貂进行解剖,发现其肺脏有明显出血斑,并伴有坏死灶、钙化灶;组织切片显示,肺泡壁不清,肺脏组织有散在慢性炎性细胞、红细胞;通过无菌技术从肝脏中分离得到一株细菌,经分子生物学鉴定确定其为肺炎克雷伯氏菌。说明水貂所患疾病是由肺炎克雷伯氏菌感染引发的肺炎。     

两株不同血清型鱼源无乳链球菌生物学特性的比较研究

为分析裂腹鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)血清型Ia型和Ⅲ型的生物学特性的差异,本研究对该菌Ia型(S07)与Ⅲ型(S03)两株菌的生长曲线、耐药性、粘附和侵入能力、致病性,以及环境因子(pH、温度和盐度)对两株菌生长的影响等特性进行比较研究。结果显示,Ⅲ型S03株生长速度显著快于Ia型S07株。S03株生长受pH、温度和盐度的影响比S07株小。S03株和S07株在蔗糖、亮氨酸芳胺酶、β-溶血和VP试验等40种生化反应中结果一致,但S03株在葡萄糖、麦芽糖、α-葡萄糖苷酶和磷酸盐等11种生化反应中均呈阳性,而S07株呈阴性。S03株的耐药性明显强于S07株,且S03株表现出7重耐药,而S07株对所测抗生素均敏感或中度敏感。S07株黏附能力显著强于S03株。S07株对齐口裂腹鱼和斑马鱼的毒力(LD_(50)分别为8.9×10~3 cfu/mL和1.88×10~3cfu/mL)显著强于S03株(LD_(50)分别为5.27×10~8 cfu/mL和7.09×10~7 cfu/mL)。研究表明裂腹鱼源Ia型和Ⅲ型无乳链球菌在多种生物学特性上存在明显差异。本研究为阐明不同血清型无乳链球菌的致病机理及该菌引起的疾病的防治提供了实验依据。     

貉源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及药敏试验

为确定河北昌黎地区某养殖场貉呼吸道疾病引起死亡的病因,本研究从送检的貉病料肺脏中分离到1株革兰氏阴性短杆菌,并对分离株进行形态学观察、16S rRNA序列测序及全自动细菌生化鉴定仪鉴定,在此基础上完成了分离株的分型、人工感染小鼠试验及药敏试验等。结果显示,该分离株为非K1/K2型肺炎克雷伯菌,并将其命名为CLKp18;该分离株的16S rRNA基因序列与GenBank中登录的多株肺炎克雷伯菌参考株同源性均高达99%。Vitek全自动细菌鉴定仪结果表明,该菌株与肺炎克雷伯菌鉴定标准相似度为99%。人工感染小鼠试验结果显示,试验组小鼠在攻毒后6 h开始出现临床症状。无菌取出死亡小鼠的肺脏、肝脏、脾脏及肾脏,划线涂板,均可分离到该菌,表明该分离株感染小鼠后,能侵入到小鼠体内多个组织器官,引起不同程度的病变,尤以肝脏和肺脏病变较为明显,对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为2.17×10~7 CFU。药敏试验结果表明,该菌对单环内酰胺类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类及大部分头孢类耐药,但对阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶和亚胺培南敏感。本研究结果确定了引起本次貉呼吸道症状疾病的致病菌为非K1/K2型肺炎克雷伯菌,且该分离株有较强的致病性和多重耐药性。本研究为临床治疗由该菌引起的貉肺炎提供了参考依据。     

空肠弯曲菌致GBS动物模型的建立

[目的]利用巴马小香猪构建空肠弯曲菌致GBS的动物模型。[方法]选取致人GBS源空肠弯曲菌株,采用3×1012 cfu/m L、3×1011 cfu/m L、3×1010 cfu/m L、3×109 cfu/m L等浓度对4组巴马小型猪灌胃攻毒,每头猪攻毒10m L,同时设立对照组。从第二周开始定期采集组织样及血液样本,通过免疫学检测及组织病理切片判定病变情况。[结果]免疫学检测发现,在16份攻毒组样品中有12份血清中GM1-Ig G抗体检测阳性,阳性检出率为81.25%。但是,并没有显著的攻毒浓度梯度差异。病理组织切片H/E染色显示,抗体阳性试验猪的大脑出现了噬神经元、小血管周围间隙增宽、神经中央染色溶解等现象;切片LFB染色显示,在发病模型动物的小脑白质和腰膨大出现了轻度脱髓鞘现象。[结论]结果表明空肠弯曲菌诱导GBS的浓度在3×109 cfu/m L~3×1012 cfu/m L均可,组织样本及血液采集在攻毒后4~5周较理想。