猪源致病性大肠杆菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区的SSOP分析

DNA旋转酶基因gyrA中喹诺酮耐药决定区碱基变换在大肠杆菌对喹诺酮的耐药性方面起着十分重要的作用.采用PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)技术可对大肠杆菌gyrA基因QRDR的突变进行有效检测.本文以142株猪源致病性大肠杆菌氟喹诺酮药物敏感菌株为样本,测定了细菌对喹诺酮药的MIC值,结果表明142株猪源大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的耐药率分别为78.8%,56.3%,65.5%,76.8%.猪源大肠杆菌对氟喹诺酮药物的耐药率高,且耐药菌株MIC值较大.菌株WJPE2-1(对环丙沙星的NIC为0.5μg/mL)的诱导耐药试验,结果表明,在通过药物浓度梯度连续诱导过程中获得了MIC为2,8,64,128μg/mL的四株诱导菌株,诱导菌株4对ENR、NOR、OFL、CIP的MIC值分别增加到诱导前的32,128,128,256倍,且4株诱导菌株对CIP、ENR、NOR、OFL的MIC值均呈现递增.根据GenBank注册的大肠杆菌gyrA序列设计引物,横跨gyrA的第40和118密码子位置,包含完整的QRDR,从27株不同MIC值的大肠杆菌株、ATCC25922、4株诱导耐药菌株均获得约300bp的PCR产物.采用291的交联度、12%的聚烯酰胺浓度,1×TBE,凝胶中添加5%的甘油的条件,对诱导菌株、药物敏感菌株及不同耐药水平的分离菌株进行SSCP分析,结果表明,诱导菌株的谱型与敏感对照菌不同,低MIC值菌株SSCP谱型与敏感对照与敏感对照一致性高;耐药菌株的谱型多数与敏感对照不同.四株诱导大肠杆菌PCR产物的SSCP谱型均与对照不一致,检出率为100%;27株不同耐药性的猪源大肠杆菌中,7株敏感大肠杆菌共有6株的SSCP谱型与标准敏感菌株对照一致,符合率为85.7%;20株耐药大肠杆菌其谱型与标准敏感对照一致的菌株为2株,检出率为90.0%.序列比较结果表明,敏感菌株WJPE2-1的PCR产物与敏感对照有2个碱基(第91,111位氨基酸残基位置)的差异,序列同源率为99.16%(236/238).诱导菌株1与2表现在第83位氨基酸编码序列由tcg突变为ttg,菌株3、4与菌株1、2的差异表现在第87位氨基酸编码序列由gac突变为tac.进一步分析发现,菌株WJPE2-1在第91位及111位的突变均为同义突变,即密码子的变换没有引起氨基酸残基的改变.在诱导菌株中,1与2的gyrase的第83位氨基酸残基由Ser→Leu,菌株3、4的gyrase还在第87位氨基酸残基由Asp→Tyr.表明由于QRDR内碱基的改变,引起DNA旋转酶氨基酸的变化,导致大肠杆菌产生氟喹诺酮药物的耐药性.     

猪源链球菌对环丙沙星耐药性与耐药基因突变的相关性研究

通过微量稀释法测定28株猪源链球菌对环丙沙星的MIC值,研究东北地区猪源链球菌对环丙沙星耐药性与parC、gyrA基因突变的相关性.通过PCR方法扩增parC和gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)并测序分析;18株耐药菌在parC基因80位的突变(AGC→ATT)导致氨基酸Ser→Ile突变,11株高度耐药菌在gyrA基因81位的突变(CAG→)CAT、CTT或CTA)导致氨基酸Ser→Ile、Phe或Tyr的突变.当菌株对环丙沙星的MIC值≤1μ/mL时,parC和gyrA基因的QRDR区均未有突变;而当MIC ≥2μg/mL时,ParC的氨基酸发生了Ser80→Ile的突变,同时发生GyrA氨基酸Ser81突变的菌株,耐药水平很高.研究表明,环丙沙星低水平类耐药是由于拓扑异构酶Ⅳ改变引起,而高水平耐药是由拓扑异构酶Ⅳ、DNA旋转酶共同改变引起的.实验结果证明,在一定条件下,耐药性的高低与突变位点的多少成正比.     

牦牛源巴氏杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药表型及耐药基因检测

从西藏不同地区规模化养殖场和兽防站(局)采集的疑似呼吸系统疾病症状的病死牦牛肺组织样品220份,通过细菌培养特性、染色镜检、微生物鉴定系统分离出44株巴氏杆菌。采用微量肉汤稀释法,测定了氟喹诺酮类6种抗菌药物和黏菌素药物对44株细菌的抗菌活性。采用PCR技术,进行氟喹诺酮类耐药基因的检测。结果表明,氟喹诺酮类6个药物的最小抑菌浓度(MIC)范围多在0.125~128μg/mL之间,黏菌素药物的MIC范围为0.016~8μg/mL。环丙沙星和加替沙星对临床分离的巴氏杆菌的耐药率分别为52.27%和54.55%,黏菌素对巴氏杆菌的耐药率为4.55%,粘菌素对大多数巴氏杆菌菌株的MIC值2μg/mL。PCR结果显示,氟喹诺酮类qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr基因的阳性检出率分别为29.55%、18.18%、22.73%和18.18%,但qnrC、qnrD、qepA基因未检出。研究结果提示,大多数菌株对氟喹诺酮类药物存在交叉耐药现象,故临床应加强耐药性及耐药基因的检测。     

耐药金黄色葡萄球菌gyrA基因突变与中药耐药抑制剂的回复突变研究

探讨金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类的耐药与gyrA基因突变的关系及中药耐药抑制剂对gyrA基因是否具有回复突变作用,以便从分子水平初步探讨复方中药耐药抑制剂的耐药抑制分子机理。用诺氟沙星逐步诱导金黄色葡萄球菌敏感株ATCC29213,建立了MIC值为64μg/mL、128μg/mL和256μg/mL的耐药突变株;PCR扩增标准株、耐药株和中药处理的耐药株gyrA基因,产物回收纯化后送测序公司测序。gyrA基因测序结果用DNAsis软件分析表明,细菌的耐药性程度越高,碱基突变率增加;gyrA基因氨基酸序列突变分析表明,84位亲水性丝氨酸被疏水性缬氨酸取代,与细菌的高水平耐药性密切相关。中药耐药抑制剂对84位和99位氨基酸突变具有回复突变的作用。结论:中药耐药抑制剂对耐药金黄色葡萄球菌gyrA基因具有回复突变作用。     

大肠杆菌多重耐药株的体外诱导初步研究

为了解不同抗菌药物对大肠杆菌体外耐药诱导株的MIC变化特点,以盐酸四环素、盐酸环丙沙星、水杨酸钠、氯霉素作为诱导剂,采用1／2×MIC诱导法,对大肠杆菌质控菌株ATCC25922进行体外诱导试验。于诱导前对试验菌株进行形态学观察和生化鉴定,并于诱导过程中对试验菌株进行形态学观察。于诱导前测定16种抗菌药物对质控菌株的MIC,并于诱导剂浓度达到128×MIC时,测定16种抗菌药物对4株诱导菌株的MIC。结果表明,试验菌株的形态特征和生化反应特性与大肠杆菌一致。诱导前,16种抗菌药物对质控菌株的MIC为0．25-64．00μg／mL;头孢噻肟、盐酸四环素、土霉素、甲砜霉素、诺氟沙星、头孢西丁等抗菌药物对盐酸四环素诱导株的MIC与质控菌株相比．提高幅度均达到或超过4倍,均具有显著性意义;头孢噻肟对盐酸环丙沙星诱导株和氯霉素诱导株的MIC与质控菌株相比．提高倍数都超过了4倍,而其余抗菌药物的MIC变化均无显著性意义。水杨酸钠诱导剂浓度大于16×MIC时,菌株不能生长。结果提示。抗菌药物对盐酸四环素诱导株的MIC变化最明显,表明大肠杆菌在四环素的选择性压力下较易产生耐药性。     

鸡源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性分析及相关耐药突变研究

本试验采用药敏纸片法对2014年从13个不同规模化鸡场分离的135株鸡源大肠杆菌进行常用12种抗菌药物敏感性试验,结果表明,头孢西丁和阿莫西林/棒酸耐药率较低,分别为17.8%、18.5%,而氟喹诺酮类的环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率较高,分别为68.9%、65.2%和63.7%;进一步对高耐药率的氟喹诺酮类耐药菌株测定环丙沙星MIC值为4~256μg/ml;PCR扩增相关耐药基因(gyr A和par C),并测序分析耐药决定区突变及与MIC对应关系表明,耐药菌株突变主要发生在gyr A基因的Ser83密码子和Asp87密码子,及par C基因的Ser80密码子和Glu84密码子上,不同突变类型分别对应一定MIC值范围,其中73.1%(57/78)突变类型为gyr A基因的C(Ser83)→T(Leu)和G(Asp87)→A(Asn)突变,及par C基因的G(Ser80)→T(Ile)突变,其MIC值在8~256μg/ml之间;本研究提示规模化鸡场在防治大肠杆菌等细菌病时,应根据药敏结果选用药物,少用或不用氟喹诺酮类药物。     

副猪嗜血杆菌链霉素耐药基因rpsL、rrs分析和关键位点的鉴定

为研究副猪嗜血杆菌(HPS)链霉素(SM)抗性的分子基础,本实验采用甲基磺酸乙酯(EMS)间断传代诱导HPS SC1401菌株,构建SM抗性突变株,测定其对SM的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并对其耐药基因rpsL和rrs进行测序;通过对比分析筛选出rpsL基因中两个引起SM完全耐药的突变位点;为了进一步验证突变位点与抗性的关联性,设计位点突变引物以构建突变型质粒,并分别转化到亲本株中,获得单一位点突变菌株,测定其对SM的MIC和MBC。结果显示:EMS诱导的SM抗性突变菌株rpsL基因第43号(AAA→AGA)或第88号密码子(AAA→AGA)发生了突变,rrs基因未检测到突变;该抗性突变菌株与单一位点突变菌株1401D43和1401D88对SM的MIC和MBC均大于8 192μg/mL,远高于亲本株SC1401的SM抗性水平。实验结果表明,HPS的SM抗性主要由rpsL基因特定位点突变引起,其中,rpsL基因第43号和第88号密码子为主要突变位点。本实验为完善HPS耐药分子机制研究,特别是对氨基糖苷类药物产生耐药的分子基础提供一定的参考。     

禽巴氏杆菌链霉素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(Pm)链霉素(Str)敏感株与耐药株(MIC=1024μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Str敏感株与耐药株进行双向测序,筛选得到差异表达基因,通过GO、KEGG和ARDB数据库对差异表达基因进行分组和富集性分析,并利用荧光定量PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。结果显示,共筛选获得625个差异表达基因,其中包括581个上调基因和44个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数发挥细胞膜转运功能;对差异表达基因进行信号通路富集性分析显示,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与双组分系统代谢途径中;采用ARDB对差异表达基因进行耐药基因分析,显示其中的耐药基因主要为氨基糖苷转移酶类和外排系统两类。本研究结果表明,禽源Pm对Str的耐药机制可能与细胞膜上多药外排泵的过量表达和氨基糖苷转移酶类灭活抗菌药物有关。同时,也为进一步研究禽源Pm对Str的耐药机制奠定了基础。     

鸡源大肠杆菌质粒介导的氟喹诺酮类药物耐药基因qnrA的分子检测

对2005年~2007年从豫北地区临床分离的377株鸡源大肠杆菌进行生化鉴定,MIC值测定。被测菌株对氟喹诺酮类（FQs）药物恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星均呈严重耐药,耐药率分别为94.9%、93.9%、94.9%。选取对恩诺沙星耐药（MIC>32 μg/ml）的235株大肠杆菌进行qnr基因的分子检测,结果显示仅有1株大肠杆菌（MIC=128 μg/ml）呈qnr基因阳性,经测序分析该基因命名为qnrA。     

猪链球菌2型多重耐药菌株的人工诱导

采用6种常用抗菌药物对临床分离的38株猪链球菌2型进行敏感性检测,从中选择3株对红霉素和环丙沙星敏感的菌株,采用体外递增药物浓度的方法分别诱导成对红霉素和环丙沙星耐药的菌株,按临床检验标准委员会(CLSI)推荐的方法测定了红霉素和环丙沙星对同一亲本的敏感株和诱导耐药株的体外最小抑菌浓度(MIC),并测定在外排泵抑制剂利血平存在的情况下敏感株和诱导耐药株的MIC变化情况。微量稀释法测定的MIC结果显示:在所选的6种抗生素中,氟苯尼考和氨苄西林对临床分离的38株猪链球菌的作用最好,抑菌率都为100%,红霉素及环丙沙星有一定作用,耐药率分别达39.5%(15/38)和28.9%(11/38),而磺胺间甲氧嘧啶、四环素的抑菌效果最差,耐药率达100%。浓度递增法成功诱导了猪链球菌2型菌株对红霉素和环丙沙星耐药性,其MIC值分别由0.001 8 mg/L上升至128 mg/L。在外排泵抑制剂利血平存在的情况下,抗菌药物对部分猪链球菌2型菌株的MIC值下降。结果提示:逐步增加药物浓度可以诱导猪链球菌2型菌株对红霉素和环丙沙星的耐药性,而且猪链球菌2型菌株耐药性的产生可能与耐药性相关的主动外排机制有关。     

五种喹诺酮类药物体外诱导鸡白痢沙门菌耐药与交叉耐药的研究

采用萘啶酸、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、加替沙星等5种喹诺酮类药物进行了鸡白痢沙门菌体外诱导耐药试验,观察和分析了细菌耐药性发展进程及药物间的交叉耐药情况。鸡白痢沙门菌标准株C79-3以药物浓度递增法分别在5种药物的次抑菌浓度下诱导传代至30代,每10代进行药敏试验检测耐药性,并对诱导株诱导前和诱导30代后的药物最低抑菌浓度(MIC)进行测定和比较。结果:随着诱导代次增加,诱导株对诱导药物的敏感性逐渐下降,至30代时所有诱导株均对诱导药物产生耐药。不同药物诱导耐药的进程有一定程度的差异,萘啶酸最易诱导耐药,其次为恩诺沙星、环丙沙星和加替沙星,最后为诺氟沙星。环丙沙星诱导株的环丙沙星MIC增幅最大,萘啶酸诱导株的萘啶酸MIC值最高。5种药物间存在不同程度的交叉耐药现象,恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星之间为双向交叉耐药,而萘啶酸与恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星和加替沙星间以及加替沙星与恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星间为单向交叉耐药。此外,药物间的交叉耐药与菌株的耐药水平密切相关。     

禽巴氏杆菌四环素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(avian Pasteurella multocida,Pm)四环素(Tetracycline,Tet)敏感株与耐药株(MIC=32μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Tet敏感株与耐药株进行双向测序,通过GO、KEGG和ARDB数据库对表达差异基因进行注释和富集性分析。结果显示,共筛选出442个差异表达基因,其中包括103个上调基因和339个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数富集于核糖体结构成分、rRNA结合、跨膜运输和离子转运等生物过程;对差异表达基因进行信号通路富集性分析,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与核糖体代谢途径中;对差异表达基因进行耐药基因注释(ARDB),发现其中的耐药基因主要为核糖体保护蛋白和外排系统两类。本研究表明禽源Pm对四环素耐药的耐药机制可能与细胞膜上ABC转运蛋白的过量表达以及核糖体保护蛋白有关。     

PmrA-PmrB二元调控系统介导大肠杆菌对黏杆菌素耐药的机制研究

已报道PmrA-PmrB二元调控系统在革兰阴性菌对多黏菌素B耐药过程中起重要作用,基于此认识,作者拟从基因突变和mRNA表达两个方面探讨PmrA-PmrB介导大肠杆菌对黏杆菌素耐药的可能性。首先检测了临床分离的52株禽致病性大肠杆菌对黏杆菌素的敏感性,筛选出耐药菌株;然后采用step-wise方法对黏杆菌素敏感菌株进行诱导,获得人工诱导的耐药菌株;最后通过PCR扩增所有耐药菌株的pmrA-pmrB后采用Mega软件进行突变位点分析,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测所有耐药菌株中pmrA-pmrB的mRNA转录水平的变化,拟阐明PmrA-PmrB二元调控系统对禽致病性大肠杆菌黏杆菌素耐药性产生的作用。MIC结果显示,52株大肠杆菌中,虽然大多数菌株(88.5%,46/52)仍对黏杆菌素敏感,但也分离到少数耐药菌株(为11.5%)。突变位点分析表明人工诱导成功的5株耐药菌(9R、36R、53R、91R和107R)pmrA未发生突变,而pmrB均有不同程度的突变,其中耐药菌株9R、36R和53R各在G55A(G19R)、T500C(L167P)和T263A(V88E)发生点突变,而91R和107R在229位和478位各插入长为30和189bp的序列。但临床分离的6株耐药菌株(MIC=4~8μg·mL~(-1))的pmrA-pmrB均未发生突变。qRT-PCR结果显示发生点突变的三株人工诱导耐药菌pmrA-pmrB转录量均极显著(P0.01)或显著(P0.05)上升,发生插入突变的两株耐药菌pmrA-pmrB转录量虽有上升趋势,但变化不显著(P0.05),而临床耐药菌株(n=6)的pmrA-pmrB转录量均无变化。进一步检测人工诱导不同MIC的耐药菌株中pmrA-pmrB的突变位点,发现菌株MIC达16μg·mL~(-1)时pmrA-pmrB才会发生突变。PmrA和PmrB介导了大肠杆菌对黏杆菌素的高度耐药,其中PmrB的点突变伴随PmrA-PmrB的高表达或者PmrB的组氨酸激酶-腺苷酰环化酶-甲基结合蛋白-磷酸化酶(HAMP)结构域的插入突变是导致禽致病性大肠杆菌对黏杆菌素高度耐药的机制之一。     

鸡沙门菌环丙沙星耐药株acrA基因突变特征分析

提取体外诱导的3株不同耐药水平鸡源性沙门菌环丙沙星耐药株的染色体DNA(分别为16×MIC、64×MIC、128×MIC).设计引物acrAF和acrAK,对耐药菌株acrA全基因序列进行克隆及序列分析.与质控菌株C79-13相比,菌株16×MIC的acrA基因第121位碱基发生T→C突变;菌株64×MIC的acrA基因第393位碱基发生C→突变,第1109位碱基发生A→G突变;菌株128×MIC的acrA基因第1121位碱基发生C→T突变.菌株16×MIC的碱基突变导致acrA基因的第40位氨基酸发生M→T取代,即Met→Thr;菌株64×MIC的碱基突变导致acrA基因的第131位氨基酸发生A→C取代,即Arg→Cys;而菌株128×MIC碱基突变并没有导致相应氨基酸的改变.上述结果提示,acrA基因的突变可能并非鸡源性沙门菌耐药性产生的主要原因.     

动物源耐氟喹诺酮类药物致病性大肠杆菌gyrA基因的突变研究

用微量稀释法测定盐酸环丙沙星等5种氟喹诺酮类抗菌药物对20株耐氟喹诺酮类药物的动物源致病性大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC),PCR扩增gyrA基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining regions,QRDR),扩增的片断长度为496 bp,PCR产物直接测序,用DNAStar软件分析氨基酸序列。结果显示,盐酸环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星和烟酸诺氟沙星的MIC范围分别为64～>512μg/mL、16～256μg/mL、16～128μg/mL、64～>512μg/mL和64～>512μg/mL。gyrA基因的突变位点均位于83和87位氨基酸位点,主要的变异方式为Ser83→Leu(15/20),其次是Asp87→Asn(13/20),其他的为Asp87→Tyr(6/20),Ser83→Trp(4/20),Ser83→Ala(1/20)和Asp87→Gly(1/20)。说明试验用菌株对氟喹诺酮类药物均表现为多重耐药,其gyrA基因QRDR的突变表现为多种形式。     

沙门菌体内耐药性诱导模型的建立和体内外诱导耐药菌基因差异分析

以秀丽隐杆线虫N2野生型为宿主,将鼠伤寒沙门菌ATCC13311定植于线虫体内,然后使用梯度浓度递增法提高培养液中的环丙沙星浓度,诱导沙门菌在线虫体内产生耐药性,同时进行体外诱导耐药试验。对体内、外诱导耐药菌的gyrA、gyrB、parC和parE基因的氟喹诺酮耐药决定区(Quinolone resistance determining regions,QRDR)和外排泵抑制子基因(acrR、marR、ramR和soxR)进行PCR扩增、测序和分析。结果表明,鼠伤寒沙门菌ATCC13311定植于线虫体内,经过诱导后得到环丙沙星MIC为4 mg/L的耐药菌TN4,体外诱导试验获得环丙沙星MIC为4μg/mL的耐药菌TW4。TN4的gyrA基因发生了Asp87Asn突变。体外诱导耐药菌TW4的gyrA基因发生了Ser83Phe和Asp87Val突变,ramR基因出现了20bp的缺失。本研究建立了鼠伤寒沙门菌-秀丽隐杆线虫体内耐药性诱导模型,并比较了体内、外诱导耐药菌的基因突变差异,为进一步研究细菌在动物体内的耐药机理奠定了基础。     

大肠杆菌acrR插入序列对acrAB表达水平及多重耐药性的影响

为研究大肠杆菌(E.coli)分离株ED28的acrR基因中777bp插入片段对外排泵AcrAB表达水平及多重耐药性的影响,本研究将野生型acrR通过互补实验导入ED28中得到C-ED28。通过药物的最低抑菌浓度(MIC)测定、有机溶剂耐受性试验和实时定量PCR(qPCR)等方法检测菌株中AcrAB外排泵的活性。通过PCR方法检测ED28和C-ED28喹诺酮耐药决定区(QRDR)的氨基酸突变及携带的质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因。结果显示,临床分离菌株ED28对12种抗生素呈多重耐药表型,而互补菌株C-ED28恢复了对多种药物的敏感性。当能量抑制剂(CCCP)存在时,喹诺酮类和β-内酰胺类药物对ED28的MIC普遍降低,而对C-ED28的MIC保持不变。ED28对染料溴化乙锭(EB)的MIC为512μg/mL,对正己烷和环己烷耐受;而C-ED28对染料EB的敏感性增强,MIC为16μg/mL,对正己烷耐受,对环己烷不耐受。qPCR结果显示,基因acrA和acrB在C-ED28中的表达水平低于亲本菌株ED28,而基因marA在C-ED28中的表达水平高于ED28。靶位突变检测和耐药基因检测结果显示,ED28存在gyrA(Ser83Leu和Asp87Asn)和parC(Ser80Ile)双突变,携带aac(6’)-Ib-cr、blaCTX-M-27和blaTEM-13个质粒编码耐药基因;而C-ED28仅存在gyrA(Asp87Asn)一个突变位点,并丢失aac(6’)-Ib-cr、blaTEM-1两个基因。     

猪源大肠杆菌质粒和染色体介导的喹诺酮类药的耐药机制

采用微量肉汤稀释法对31株猪源大肠杆菌进行6种喹诺酮类药物的敏感性测定,聚合酶链式反应检测质粒介导的喹诺酮类耐药（PMQR）基因qnr、qepA和aac（6′）-Ib-cr,并分析PMQR基因阳性菌株染色体gyrA、gyrB、parC、parE基因的喹诺酮耐药决定突变区（QRDRs）突变。结果显示,31株猪源大肠杆菌对兽医临床常用的氟喹诺酮类药物均呈现耐药。在31株猪源肠杆菌中共检测到2株携带qnrB10和4株携带qnrS1基因的大肠杆菌,未检测到qnrA、qepA和aac（6′）-Ib-cr。在PMQR阳性菌株gyrA基因的QRDRs中,低耐药菌株的gyrA基因出现83位S→W突变,高耐药菌株的gyrA基因同时出现83位S→L和87位D→N突变。而在parC基因的QRDRs中,大部分耐药菌株出现80位S→I突变,1株耐药菌株出现45位V→L突变。gyrB和parE基因的QRDRs未检测到突变。结果表明,本地区猪源大肠杆菌对兽医临床常用的氟喹诺酮类药物耐药严重,PMQR的出现和QRDRs的点突变可同时协同贡献对喹诺酮类耐药,而PMQR的出现加速了喹诺酮类耐药基因的快速传播。     

动物源大肠埃希菌gyrA基因突变与氟喹诺酮耐药相关性分析

为了解动物源大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药情况及其与gyrA基因突变的联系,采用微量肉汤稀释法测定200株猪鸡源大肠埃希菌对恩诺沙星和氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC);对大肠埃希菌的gyrA基因片段进行PCR扩增,产物进行变性高效液相色谱(DHPLC)检测和序列测定。结果表明,200株动物源大肠埃希菌对恩诺沙星和氧氟沙星的耐药率分别为44.5%和41.0%;144株大肠埃希菌gyrA基因产物的DHPLC图谱有异常峰型,即核苷酸突变率为72.0%;测序证实gyrA基因存在5个突变位点,其中2个位点的突变可导致Ser83→Leu和Asp87→Asn/Tyr,突变率分别为54.0%和24.0%,其余3个位点为同义突变点;结合恩诺沙星耐药情况可知,敏感菌株gyrA基因的氨基酸突变率最低(18.5%),其次为中介菌株(56.5%),耐药菌株最高(78.6%),氧氟沙星测试结果与此趋势一致。由此可知动物源大肠埃希菌gyrA基因突变引起的氨基酸替代与氟喹诺酮耐药高度相关。     

安妥沙星体外诱导大肠埃希菌耐药研究

为了探讨耐药外排泵AcrAB-TolC在大肠埃希菌对安妥沙星的诱导耐药中的发生机制,试验采用微量肉汤稀释法测定安妥沙星对大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)的最小抑菌浓度(MIC),以1/2 MIC为起点采用浓度递增法对ATCC25922进行体外诱导,并将诱导后的细菌在不含药的培养基上传代培养5次,每次传代后测定MIC值,以获得稳定耐药的菌株。并检测安妥沙星诱导前后大肠埃希菌株外排泵AcrAB-TolC基因序列的突变和mRNA表达量的变化。结果表明,诱导后的耐药菌株acrA有8处、acrB有40处、tolC有27处发生了碱基突变,其中acrB和tolC所编码的氨基酸序列也发生了改变,并且诱导后的菌株耐药外排泵AcrAB-TolC的基因acrA、acrB、acrZ、tolC的mRNA表达量极显著增加。