果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能,本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计,并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法,检测得到该dsRNA的RNAi效率。实验结果表明:Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 3基因的功能提供一定的技术支持。     

利用DNA池和测序技术快速筛查SNPs及估算基因频率

选取具有明显品种差异的3个猪品种(可乐猪、白香猪和大约克)构建品种DNA池,采用PCR产物直接测序法研究公猪外周致密纤维(ODFP)基因3'UTR、CDS、5'UTR序列(994 bp)的多态性,快速筛查到2个可能与精液品质相关的SNPs(C675T、C786T);其中,C675T导致天冬氨酸变成异亮氨酸。进一步利用测序图中SNPs等位基因峰高的比值估算各猪品种等位基因的频率。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

RNAi分子机制和研究方法进展

RNAi,即RNA干扰,是生物体感受双链RNA后诱导同源靶基因沉默的现象.RNAi现象最早是在对线虫的研究中发现长双链RNA(dsRNA)导致线虫同源mRNA降解,后来发现,dsRNA相比正义、反义单链RNA具有更强的基因沉默效应[1].     

山羊Wnt6基因克隆及组织表达分析

为了研究Wnt6基因在简州大耳羊不同器官组织中的表达水平,试验采用RT-PCR方法克隆山羊Wnt6基因序列,采用荧光定量PCR技术检测该基因在各器官组织中的表达情况。结果表明:获得山羊Wnt6基因序列1 120 bp(Gen Bank登录号为KU950833),其中CDS为1 098 bp,5'UTR16 bp和3'UTR 6 bp,编码365个氨基酸,存在1个信号肽剪切位点,跨膜序列为7~29位氨基酸。氨基酸同源性比较发现,山羊Wnt6与绵羊和牛的同源性最高达99%;山羊Wnt6基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌、股二头肌、臂三头肌中存在广泛表达,且在脂肪组织中的表达水平极显著高于其他器官组织(P0.01)。     

Tektin3基因在猪生殖系统发育中的表达规律研究

TEKTIN是附着于精子尾部基因丝的重要组分,对于基因丝的稳定和结构的复杂性起重要作用。Tektin3是其家族成员之一。研究采用RACE方法,获得梅山猪Tektin3基因全序列,利用生物信息学方法分析其结构和功能,采用半定量的方法研究150日龄梅山公母猪23个不同组织Tektin3基因的表达特征,并用Realtime PCR方法分析2、30、60、90和150日龄梅山公猪睾丸的表达规律。结果表明:(1)Tektin3基因全序列1 761bp,包含5'UTR 95bp,完整的CDS序列1 473bp和3'UTR 193bp,编码490个氨基酸,相对分子质量为56 481.3,理论等电点为7.94。(2)Tektin3基因在睾丸中高丰度表达,在下丘脑和子宫角中表达丰度较低。(3)Tektin3基因从梅山猪60日龄开始表达,到90日龄时显著下降(P0.05),150日龄时显著上升(P0.05)。结果表明该基因编码氨基酸除与精子发生有关,可能还与部分组织或器官的纤毛发生及公猪的性发育有关。     

RNA干扰抑制家畜病毒感染的研究进展

RNAi(RNA-mediated interference)是一种由序列特异性的dsRNA(double stranded RNA)作为触发器来触发同源mRNA降解从而引起基因沉默的细胞机制。利用RNAi方法可以通过沉默特异基因来对目的基因进行功能性分析,另外通过干扰RNA抑制病原性基因的表达来进行病毒性疾病治疗的研究已取得了显著的成就。作者对RNAi的作用机制、RNAi在抑制病毒复制和抵抗病毒感染动物方面的研究进展及应用前景和存在问题进行了综述。     

猪DAZ基因的DNA池测序分析

选取大约克猪、白香猪、可乐猪3个猪种的公猪构建品种DNA池。对DAZ基因的部分CDS区和3'UTR进行PCR扩增,并对PCR产物进行测序。结果表明,3个猪种中,DAZ基因的该序列未发现任何突变。同源性分析结果表明,猪与人、猩猩、猴、鼠、牛的DAZ基因该序列核苷酸同源性分别为97.0%、95.2%、96.1%、92.9%、97.0%。说明在哺乳动物中,其DAZ基因CDS部分序列和3'UTR是高度保守的。系统进化分析结果表明,猪和牛在一个进化支上。蛋白疏水性分析表明,在17－20位有个强疏水区。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

HEBP1基因敲除对牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中增殖的影响

为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。     

RNAi技术及其在病毒学防治中的研究

<正> RNAi(RNA interference)即 RNA 干扰,指由双链 RNA(dsRNA)所引发的使细胞浆内同源 mRNA 降解的转录后基因沉默现象。现已知在大多数有机体包括真菌、植物、昆虫、哺乳动物和人体细胞内都存在这种现象,被认为是机体的一种原始防御功能,在进化上具有高度保守性。近年来,随着对 RNAi 机理研究的进一步深入,这一热点问题受到越来越多的关注,并迅速在多个领域展开,从而加速了对基因功能、遗传规律机理、疾病机理的研究。大量公开发表的老鼠试验和实验室研究成果表明,基于 RNAi 技术的药物有望治疗癌症、丙肝和艾滋病等病毒性疾病,甚至可能用来治疗神经系统疾病。2002年12月,《科学》杂志将 RNAi 评为2002年十大科技进步之首,麻省理工大学的生物学家、诺贝尔奖获得者 Sharp 认为,RNAi 技术将成为十年来甚至几十年来最重要和激动人心的科学突破。本文对其研究进展进行综述。1 作用特点1.1 dsRNA 的浓度依赖性由 dsRNA所诱发的 RNAi 效应的强度随着其浓度的增高而增强。高浓度的 dsRNA 产生较多的siRNA,不但能增强反应体系的效应,而且能抵消 ADARs(RNA 依赖的腺苷脱氨酶)的作用。ADARs 能不规则地脱去 dsRNA中腺苷酸上的氨基,增加了错配几率,进而抑制 RNAi 效应。但如果 dsRNA 浓度过     

藏猪与大约克猪EDN1基因多态性与表达差异分析

为探究EDN1基因在猪脂肪沉积机制中所发挥的作用,本实验利用RT-qPCR技术对藏猪及大约克猪心脏、背脂及背最长肌组织中EDN1基因的mRNA表达量进行检测,并采用Sanger测序法对藏猪和大约克猪EDN1基因3'UTR和5'UTR区域进行了单核苷酸多态性(SNPs)筛选与基因分型.结果表明:在不同品种猪中,藏猪心脏组...     

RNAi技术抑制禽主要病毒感染的研究进展

RNA干扰(RNAi)是由内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象.1998年,Fire首次发现dsRNA并将其注入线虫(C.elegans)体内可特异性抑制基因表达,将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象称为RNAi.     

RNA干扰在动物生殖生物学研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指双链RNA(dsRNA)分子在mRNA水平抑制相应基因的表达或使其沉默的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默。到目前为止,已经有很多试验证明RNAi作为一种基因功能研究的新手段,在哺乳动物卵母细胞及早期胚胎发育相关研究中发挥了极其高效的作用。本文综述了RNAi在哺乳动物生殖生物学研究中的应用进展。     

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酶1(SRPK1)克隆表达及功能初步分析

本研究旨在阐明猪SRPK1基因的分子特点和表达谱。以大白猪为研究对象,利用RT-PCR技术克隆SRPK1基因CDS区域,同时利用反向PCR(inverse PCR,I-PCR)技术得到猪部分SRPK1的5′UTR序列;利用生物信息学方法分析SRPK1基因核苷酸序列及编码蛋白序列的结构特点;利用荧光定量PCR(real-time PCR)检测SRPK1在1和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;构建猪骨骼肌损伤模型,研究在骨骼肌发育过程中SRPK1基因的表达特性。结果,将克隆片段拼接得到长2499bp的大白猪SRPK1基因序列,包含了1968bp完整CDS区域,分析表明其编码含656个氨基酸的蛋白质;包括2个P_Kc结构域,猪SRPK1蛋白序列与人和黑猩猩的相似性较高。通过生物信息学方法预测所得5′UTR含有多个转录结合位点:HSF1、HSF2、Ik-1、IK-2、SRY、SP1MyoD、USF、E47、p300、CP2、RREB-1、E2F和AP-1。利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示猪该基因表达具有组织和种间特异性,主要都是在胃、大肠和小肠中表达。SR-PK1基因在整个损伤修复过程中的表达反复出现升高和降低。5′UTR处有多个和肌肉生长相关蛋白的转录结合位点,主要在消化系统组织表达,在骨骼肌修复中表达上调,推测其可能与骨骼肌细胞发育或其他肌肉生长相关因子的表达有关。     

siRNA 介导的家蚕ABC转运蛋白相关基因的干涉研究

由siRNA(smallinterferingRNA)介导的RNAi作为一种工具已被广泛用于基因功能研究中,并有望应用于生物体疾病的防治方面。通过显微注射,在家蚕中以siRNA介导的方式,对家蚕ABC转运蛋白(ATPbindingcassettetransporter)系列相关基因(Bmwh1,Bmwh2,Bmwh3)进行了siRNA干涉研究,在部分基因中得到了高效特异的干涉现象。结果初步证实正义链3′碱基错配的siRNA也具有显著的干涉效果。实验还显示了siRNA较之于dsRNA介导的RNAi更具有优势,表明siRNA介导的RNAi可作为基因功能分析和未来的基因操作手段在家蚕的研究中应用。     

鹅乙酰辅酶A酰基转移酶1基因的克隆、表达及生物信息分析

本实验旨在探究鹅乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)基因的分子结构和功能特性,及其在鹅肥肝形成过程肝脏中的表达变化。选用体型和体重相当的70日龄健康朗德鹅42只,正常填饲,填饲到21 d转为限制饲养。然后分别在填饲前(OF0)、填饲第7天(OF7)、填饲第14天(OF14)、填饲第21天(OF21)、限制饲养第7天(F7)、限制饲养第14天(F14)和限制饲养第21天(F21)7个填饲阶段各采集6只鹅肝脏组织样本;采用RT-PCR和RACE方法克隆获得朗德鹅ACAA1基因cDNA全长序列并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法检测ACAA1基因在朗德鹅不同填饲阶段肝脏中的表达。结果表明:鹅ACAA1基因cDNA全长为3 352 bp,其中CDS区为1 323 bp,5'UTR长度为77 bp,3'UTR长度为1 952 bp,编码441个氨基酸;在朗德鹅肥肝形成过程中,ACAA1基因在肝脏中的表达量呈先上升后下降的趋势,其在填饲14 d的鹅肝脏中表达量最高(P0.05),在填饲结束限饲阶段的鹅肝脏中表达最低(P0.05),限饲到21 d,其表达量恢复到填饲前水平。结果提示,ACAA1基因的表达与鹅肥肝的形成密切相关,为研究ACAA1基因在鹅肥肝形成中的生物学功能及其分子机制奠定基础。