多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

参照GenBank发表的序列，在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染l临床标本。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为10^4CFU／mL，检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为10^4CFU／mL、10^3CFU／mL和10^3CFU／mL。通过对采自临床型乳腺炎（46个）和隐性乳腺炎（167个）动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率（P〈0．01），但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著（P〉0．05）。     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

基于多重PCR方法的新疆褐牛乳中乳房炎主要致病菌的检测

为了能同时检测到新疆褐牛乳房炎乳中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌四种致病菌,试验根据GenBank中的金黄色葡萄球菌nuc、大肠杆菌phoA、无乳链球菌ef-tu和沙门氏菌invA基因保守序列设计了4对特异性引物,提取新疆褐牛77份乳样DNA,采用单一PCR和多重PCR方法进行扩增,统计琼脂糖凝胶电泳结果并计算相应感染率,比较两种检测方法的符合率,并检测多重PCR方法在牛场中的应用效果。结果表明：单一PCR方法中以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染为主,感染率分别为93.5%和76.6%。多重PCR方法中,以大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌的混合感染为主,感染率为24.7%;其次是大肠杆菌+金黄色葡萄球菌的混合感染,感染率为16.9%。对两种检测方法的结果进行比较,大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌及大肠杆菌+金黄色葡萄球菌混合感染的符合率分别为95%和93%;大肠杆菌+沙门氏菌+无乳链球菌的混合感染符合率为0,但多重PCR检出数量仅有2份;其余致病菌混合感染的符合率为100%。结合牧场的DHI报告及兽医诊断确认新疆褐牛中的乳房炎主要致病菌为大肠杆菌的单一感染和无乳链球...     

奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man荧光PCR检测方法的建立

为同时检测大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌,提高对奶牛乳房炎的诊断率,本试验针对3种病原菌的保守序列设计合成了3套特异性引物,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法。结果显示,该检测方法具有高特异性,与肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌等无交叉反应;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的最低检测浓度分别为10~(3 )、10~2和10~(4 )拷贝数/μL,敏感度较高。DNA各个拷贝数浓度的变异系数均低于2.02%,表明重复性良好。对24份临床采集奶样的检测结果表明,建立的多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法可用于临床大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测,具有良好的推广应用价值。     

奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。     

河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10~(-3) mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定及中药透皮剂治疗

对佳木斯市8所规模型奶牛场做了乳腺炎发病情况调查,随机采集了88份临床型乳腺炎乳样和176份隐性乳腺炎乳样做了细菌学检查,并对分离得到的病原菌进行鉴定,同时采用中草药透皮剂治疗发病奶牛.试验结果表明,引起奶牛乳腺炎主要病原菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌、沙门氏菌;中药透皮剂治疗奶牛乳腺炎实验表明治疗效果良好.     

奶牛乳腺炎主要致病菌的分离与鉴定

对山东省济南、泰安和临沂等地区5个奶牛场的160份乳样进行了临床型乳腺炎和隐性乳腺炎的判定检测,并进行了主要致病菌的分离鉴定.结果表明,160份乳样中有127份呈乳腺炎阳性,其中临床型乳腺炎占36.22%,隐性乳腺炎占63.78%;从这些乳样中分离到了主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌,金黄色葡萄球菌依据溶血型的不同主要有α溶血、β溶血、α β溶血和不溶血四种;大肠杆菌依据O抗原诊断血清得出主要有O2、O21、O76和O88这四种型;无乳链球菌依据溶血型主要为β溶血型.     

奶牛乳腺炎主要致病菌的分离与鉴定

对山东省济南、泰安和临沂等地区5个奶牛场的160份乳样进行了临床型乳腺炎和隐性乳腺炎的判定检测,并进行了主要致病菌的分离鉴定。结果表明,160份乳样中有127份呈乳腺炎阳性,其中临床型乳腺炎占36．22％,隐性乳腺炎占63．78％;从这些乳样中分离到了主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌,金黄色葡萄球菌依据溶血型的不同主要有α溶血、β溶血、α＋β溶血和不溶血四种;大肠杆菌依据O抗原诊断血清得出主要有02、021、076和088这四种型;无乳链球菌依据溶血型主要为β溶血型。     

甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及多重PCR检测方法的建立

旨在对甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌进行分离鉴定并建立一种病原菌多重PCR(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)检测方法。根据病原菌分离鉴定结果,选取主要致病菌金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus,S.aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和马链球菌(Streptococcus equi,S.equi)进行多重PCR检测方法的建立。提取3种标准菌株基因组并基于nuc、phoA、fneB的保守区域设计3对特异性引物,扩增预期核酸片段分别为1 319,385,109 bp,进行引物特异性MPCR验证同时对扩增条件中的退火温度、引物浓度优化,建立检测3种病原菌的多重PCR,完成样品检测评估。结果表明,山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌,设计的引物与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)、肺炎链球菌(Pneumococcus)无交叉反应,建立的多重PCR检测方法退火温度在59.4℃时最佳;在引物为0.3～...     

盐酸克林霉素对奶牛急性乳房炎病的疗效试验

对奶牛急性乳腺炎病原菌进行了分离和鉴定,鉴定出致病菌是金黄色葡萄球菌和B群无乳链球菌.用平皿二倍稀释法测定了克林霉素等12种药物对临床分离的16株金黄色葡萄球菌和10株无乳链球菌的MIC.结果显示,金黄色葡萄球菌和无乳链球菌对克林霉素敏感.临床疗效试验结果表明,克林霉素组的治愈率与感染对照组比较差异极显著(P＜0.01),克林霉素组治愈率、有效率与其它对照组比较差异显著(P＜0.05),表明克林霉素对奶牛乳腺炎病的治疗有很好的疗效.     

生鲜乳中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

针对金黄色葡萄球菌的TRAP基因设计LAMP引物,建立了金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)方法,进行了特异性和灵敏性试验,并对临床乳样进行初步检测。结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与生鲜乳中常见的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、粪肠球菌无交叉反应,灵敏度为10CFU/mL。分别用传统分离鉴定法与LAMP法对50个乳腺炎乳样进行检测,传统方法分离得到S.aureus 14株,LAMP法检测得到S.aureus 14株,符合率100%,阳性检出率均为28%。结果表明,成功建立了生鲜乳中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,该方法无需特殊的仪器,有利于在临床和基层进行推广。     

牛乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的PCR检测应用研究

采集92份患隐性乳房炎牛的乳汁,分别用PCR法和常规法进行致病菌检测,常规细菌鉴定法检测出金黄色葡萄球菌感染样18份,无乳链球菌感染样30份;双重PCR检测出金黄色葡萄球菌感染样22份、无乳链球菌感染样27份。本试验从基因水平对致病性乳汁进行检测,具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强等特点。     

江苏部分奶牛场乳腺炎病原菌的分离鉴定、耐药性及血清型研究

为查明江苏部分奶牛场乳腺炎病原菌区系分布、主要病原菌药物敏感性及其血清型,本研究从5个奶牛场采集105份临床型和144份隐性乳腺炎奶样进行了细菌分离鉴定,并对分离鉴定出的6种主要病原菌进行了药敏试验,同时对分离鉴定出的12株金黄色葡萄球菌和17株无乳链球菌,采用多重PCR进行了基因分型,并对金黄色葡萄球菌进行了血清学分型。细菌分离鉴定结果显示,5个奶牛场临床型和隐性乳腺炎病原菌检出率分别为74.34%和61.81%。病原菌区系分布主要为大肠杆菌89株(24.25%)、粪肠球菌64株(17.44%)、克雷伯氏菌23株(6.27%)、志贺氏菌19株(5.18%)、无乳链球菌17株(4.63%)、屎球菌14株(3.81%)、金黄色葡萄球菌12株(3.27%)、停乳链球菌1株(0.27%)、乳房链球菌1株(0.27%)和绿脓杆菌1株(0.27%)。药物敏感性试验结果显示,6种主要病原菌均对克林霉素耐药,耐药率达50.00%~93.75%,均对氨苄西林和氯霉素敏感,敏感率为75.00%~100%。主要病原菌血清型分型结果显示,金黄色葡萄球菌有2个血清型,主要为荚膜多糖336型(66.67%)和5型(33.33%),无乳链球菌主要有2个血清型,主要为Ⅱ型(64.71%)和Ia型(35.29%)。本研究为该地区奶牛乳腺炎临床合理用药及综合防控提供了依据。     

抗奶牛乳腺炎多价卵黄抗体的制备及含量测定

本研究的目的是制备抗奶牛乳腺炎主要致病菌的多价卵黄抗体并检测特异性抗体的含量。采用金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌混合抗原免疫产蛋母鸡。通过水稀释法分离卵黄抗体。采用ELISA法检测抗体效价和特异性抗体含量。多价抗体与大肠杆菌的结合效价最高可达25600,与金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的结合效价为12800。每毫升卵黄液中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌特异性卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin,IgY）的最高含量分别为2.13、2.01和1.92 mg。免疫后特异性抗体含量随时间变化趋势与抗体效价变化趋势一致。     

河北地区隐性乳房炎的流行病学调查

为了研究河北地区隐性乳房炎的发病情况,试验采用乳房炎体细胞数间接测定法(BMT)和细菌培养技术对河北地区6个牛场的720份奶样进行隐性乳房炎筛查和病原微生物诊断。结果表明:720份乳样中有182份为隐性乳房炎乳样,发病率为25.3%;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和溶血葡萄球菌为引起河北地区奶牛隐性乳房炎发病的主要病原菌,其中金黄色葡萄球菌所占比例最大,为20.9%。     

奶牛乳腺炎的细菌学研究

在对山东7个地区14个奶牛场临床型和隐性乳腺炎调查的基础上采集234头临床乳腺炎病牛乳样、241个隐性乳腺炎乳样并分别做了细菌学检查,结果表明:泌乳期临床型乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、酵母菌和棒状杆菌为主;干奶期临床型乳腺炎病原菌以大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和酵母菌为主;隐性乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌链球菌、酵母菌、假单胞菌和棒状杆菌为主;厌氧菌在隐性乳腺炎、干奶期乳腺炎和干奶期乳腺炎乳样的捡出率分别为 5．82％,4．17%,10．16％;隐性乳腺炎、干奶期乳腺炎细菌的共感染率较高,与泌乳期乳腺炎病原菌的差异极显著(P<0．01),隐性乳腺炎与干奶期乳腺炎病原菌共感染率差异不显著(P >0．05)。     

山东不同地区乳房炎和非乳房炎牛奶中主要病原菌的调查

通过对13个地区35个牧场的985份非乳房炎奶样和284份乳房炎奶样进行常见病原菌分离鉴定,以期了解山东地区牛奶中主要病原菌的流行情况。采用常规方法与生化鉴定、PCR技术对样品进行细菌分离鉴定,利用系统进化群试验对大肠杆菌致病性进行分析。结果显示:(1)获得金黄色葡萄球菌150株(11.82%),大肠杆菌248株(19.54%),无乳链球菌35株(2.76%),停乳链球菌18株(1.42%),乳房链球菌49株(3.86%);乳房炎样品细菌检出率(51.41%)明显高于非乳房炎样品(35.94%)(P<0.01);(2)青岛地区样品检出率(67.91%),高于其他地区(P<0.05),金黄色葡萄球菌在青岛检出率(50.0%)最高,大肠杆菌在东营的检出率(40.0%)最高;乳房链球菌在日照的检出率(31.25%)最高,无乳链球菌和停乳链球菌在各地的检出率无明显差异;(3)6月份样品中细菌检出率(67.91%)最高,且明显高于其他采样时间(P<0.01);(4)248株大肠杆菌中,共生群A群213株(85.89%),致病群35株(14.11%),乳房炎样品致病群检出率(22.39%);明显高于非乳房炎样品(11.05%)(P=0.023)。表明山东省牛奶中主要致病菌为金黄色葡萄球菌,乳房炎样品细菌和致病群检出率均高于非乳房炎样品,不同地区致病菌检出率存在差异,且夏季最高,秋冬季节低。     

牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为评价牛乳腺炎无乳链球菌重组表面蛋白(pgk)免疫原性,并通过建立检测抗体的间接ELISA方法对免疫抗体效价进行评价,本研究根据GenBank登录的无乳链球菌pgk基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板PCR扩增出pgk蛋白抗原优势区的编码基因序列。将其插入pET-30a(+)中,并在大肠杆菌中表达。Western blot鉴定表明,表达的重组蛋白与阳性血清具有良好的反应原性。采用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.115μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。初步应用于检测无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌小鼠阳性血清的检测。结果表明牛乳腺炎无乳链球菌pgk亚单位抗原具有良好的抗原性,抗体检测灵敏度达到1∶4 000,同时表现良好的特异性。