基于测序技术的海南地方猪TLR4基因多态性分析

为了了解海南地方猪TLR4基因的多态性,试验采用PCR技术对五指山猪、临高猪和屯昌猪的TLR4基因组序列进行了克隆、测序,应用DNAStar和BioEdit软件分析其序列,SMART、SOPMA、SWISS-MODEL在线软件分析TLR4蛋白的结构,并预测二级结构和三级结构。结果表明:获得的三个品种海南地方猪TLR4基因DNA序列全长均为10 435 bp,其中编码区长2 526 bp,编码841个氨基酸。三个品种猪TLR4基因序列种内比对时,五指山猪在种内有1个核苷酸位点存在多态性;屯昌猪在种内有6个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;临高猪在种内有3个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。三个品种猪TLR4基因序列种间比对时,有27个核苷酸位点存在多态性,其中2个为错义突变,导致氨基酸改变。三个品种猪的TLR4基因序列的同源性在99.8%～99.9%之间,高度保守。海南猪TLR4基因在7 209位点的G→T突变和7 781位点的G→A位点突变引起了TLR4蛋白二级结构和三级结构发生改变。说明海南地方猪TLR4基因存在多态性,并且其多态性引起的结构改变可能使TLR4基因功能发生变化。     

基于测序技术的海南地方猪TLR2基因多态性分析

为了解海南地方猪TLR2基因的多态性,本研究采用PCR法从五指山猪、临高猪和屯昌猪3种海南地方猪的血液中克隆Toll样受体2(TLR2)基因,并进行测序及序列分析。结果显示,3种海南地方猪TLR2基因的扩增长度均为2649bp,编码区长2358bp。3种猪TLR2基因序列的种内比对结果显示,五指山猪种内有7个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;屯昌猪种内有5个核苷酸位点存在多态性,均在编码区外;临高猪种内有4个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。种间比对结果显示3种猪有12个核苷酸位点存在多态性,其中3处为错义突变,导致氨基酸改变。同源性分析结果显示,3种猪的TLR2基因序列高度保守,同源性在99.6%~99.9%之间。蛋白质结构预测分析显示,海南猪TLR2基因在876、1454位点呈现的AG突变均引起了其蛋白质二级结构和三级结构的改变,提示可能存在TLR2功能的变化。本研究填补了海南地方猪TLR2基因多态性空白,为深入研究TLR2基因多态性与猪疫病易感性的关系提供基础研究资料。     

巴马香猪TLR2基因cDNA的克隆及生物信息学分析

利用NCBI公布的TLR2基因序列设计引物,RT-PCR克隆巴马香猪(Sus barbatus)TLR2基因。核酸序列分析表明,巴马香猪TLR2基因开放阅读框长2358bp,编码785个氨基酸,该蛋白等电点为7.52,相对分子质量为89480;与普通猪比对发现,巴马香猪TLR2基因有15个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为73.4%,82.4%,59.5%,85.3%,84.6%,82.4%。TLR2膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在21～22位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有4个明显的LRR,分别位于第76～99、360～385、413～432和457～476位氨基酸区;膜外区含6个N连接的糖基化位点。     

南阳黄牛TLR2基因扩增及序列分析

根据GenBank中发表的牛TLR2基因序列设计引物,通过PCR方法对南阳黄牛的TLR2基因进行分段扩增并测序,拼接后得到包含TLR2完整编码区以及5′端和3′端非编码区的2399bp的全序列。序列分析结果表明,南阳黄牛TLR2基因开放阅读框全长2 355bp,共编码784个氨基酸。南阳黄牛的TLR2基因编码区与荷斯坦牛的相比发生了16个碱基突变,其中9个发生在胞外区,2个发生在跨膜区,5个发生在胞内区,没有引起氨基酸的改变。与GenBank已发表的其他动物TLR2基因参考序列进行比较,结果显示南阳黄牛与荷斯坦牛、野牛、水牛、山羊、绵羊、猪、大猩猩和人的同源性分别为99.3%、99.3%、98.0%、96.3%、95.5%、85.4%、83.2%和83.1%。TLR2N末端存在信号肽且可能在21位氨基酸处存在裂解位点,蛋白分子结构预测TLR2蛋白含1个跨膜结构域。     

猪恒定链的原核表达及其分子结构与功能分析

为研究猪恒定链(Ii)分子结构与功能,通过PCR扩增编码完整Ii及其异构体的基因片段,克隆至T pMD18-T载体,在对目的基因进行测序及分析其基因与编码蛋白分子结构,确定功能域及其分子遗传变异的基础上,构建pET-32a-Ii重组载体,转化BL21进行诱导表达,并分析表达产物的免疫活性。结果显示,PCR扩增了645bp和837bp的Ii及其异构体编码基因,DNA序列分析其编码氨基酸分别为215个和279个,异构体Ii多出了64个氨基酸构成的Tg区;分子结构分析显示,猪Ii分子由胞内区、跨膜区和胞外区3部分组成,包含有内体定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域,其中内体定位基元含有特征性L7I和PML17双亮氨酸基序,Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列与人和小鼠Ii具有高度一致性。遗传变异分析表明,猪Ii分子与人、小鼠等哺乳动物的Ii同源性为62.7%~95.6%,与鸡、鸭、鸽、鹅等禽类Ii的同源性为48.7%~49.5%;空间结构分析显示,猪Ii有3个相似的α-helix构成,其间间隔由相似氨基酸构成的2个转角,转角关键位点氨基酸具有高度一致性;Ii编码基因在BL21细胞获得了有效表达,目的蛋白大小约41ku,Western blot和免疫荧光检测显示,表达产物具有良好的反应原性。试验成功获得了猪Ii及其异构体编码基因,明确了其功能区、分子遗传变异等特征,诱导表达获得了具有良好免疫活性的Ii重组蛋白,为进一步研究猪Ii分子结构与功能奠定了基础。     

长白猪TAS2R1基因克隆及序列分析

本研究通过引物合成、PCR扩增、胶回收和测序对长白猪苦味受体基因1(TAS2R1基因)进行序列分析。将测序得到的结果同GenBank中的TAS2R1基因序列进行比对,共发现3处突变位点。分别位于该基因的228 bp、583 bp和712 bp处。其中,在228 bp处由T突变成C,属于同义突变,其编码的氨基酸无变化;在583 bp处由C突变成G,属于错义突变,编码的氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸;在712 bp处由A突变成G,属于错义突变,编码的氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸。通过生物学信息软件DNAMAN分析,发现其与GenBank中的TAS2R1基因序列一致性达99.67%。     

类乌齐牦牛UCP3基因克隆与序列分析

利用RT-PCR方法成功克隆UCP3基因,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物学在线分析。结果表明,类乌齐牦牛UCP3基因CDS区序列长为936bp,A、G、C和T平均含量分别为20.83%、28.63%、31.09%和19.44%;与普通牛UCP3基因CDS区序列一致性高达99%;共发现碱基突变位点6个,其中同义突变4个,反义突变2个。UCP3基因共编码311个氨基酸,分子质量为34.18ku,理论等电位点9.53;其主要分布在线粒体内膜上,为非分泌蛋白;具有α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角等结构。由系统进化树可知,类乌齐牦牛与野牦牛最接近,与普通牛次之。     

猪TLR2基因Bi-PASA遗传标记的建立及多态性研究

根据人和小鼠TLR2基因序列设计了特异性PCR引物,优化PCR条件后扩增到中国梅山猪、欧洲约克夏猪、PIC-2系及PIC-3系商品猪的TLR2基因690 bp的基因片段,并对其进行序列分析。序列分析结果显示,猪TLR2基因多态性程度低,发现在猪TLR2基因编码区第1 255位点上存在1个单碱基突变位点。利用双向特定等位基因PCR扩增法(B i-PASA)建立了检测猪TLR2基因变异的遗传标记。利用猪TLR2基因的B i-PASA标记,分析了TLR2基因在大河乌猪、撒坝猪和黔邵花猪中的基因频率和多态性。研究建立的B i-PASA遗传标记和基因变异信息,将为进一步分析猪TLR2基因变异与疾病抵抗力及经济性状的相关分析提供基础资料。     

猪TGFBR1基因的克隆与生物信息学分析

TGFBR1是TGF-β/Smad信号通路中的重要成员,在哺乳动物卵泡发育和排卵过程中发挥重要作用。本文通过克隆测序技术分离猪TGFBR1基因编码区序列,采用生物信息学方法对猪TGFBR1序列信息及其与哺乳动物其他物种间的进化和系统发育关系进行分析。结果发现:猪TGFBR1基因编码区序列全长1 512 bp,编码蛋白含有503个氨基酸残基,与哺乳动物其他物种的一致性分别在90%和95%以上;猪TGFBR1蛋白具有跨膜结构、GS区和激酶结构等保守结构域。进化分析显示哺乳动物TGFBR1基因的突变已达饱和状态,在进化过程中受到负选择的影响。基于TGFBR1基因编码区序列的系统发育分析发现,猪与同属偶蹄目的普通牛、绵羊的亲缘关系较近。     

五指山猪FUT1基因SNP检测及生物信息学分析

为获得五指山猪FUT1基因序列并分析其基因结构,检测FUT1基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点在五指山猪群体中的分布情况,本试验利用PCR扩增猪FUT1基因组序列,通过基因测序寻找该基因中的SNP位点,使用PCR-RFLP方法对120头五指山猪进行了FUT1基因型检测,并运用生物信息学方法对FUT1基因序列进行分析。在猪FUT1基因组中共发现两个单碱基突变,分别位于编码区(A+307G)和3'非翻译区(A+1856C);在FUT1基因A+307G突变位点上,五指山猪均为GG基因型;此外,FUT1基因启动子区域和第2外显子处存在CpG岛。本研究成功获得五指山猪FUT1基因序列信息,为下一步五指山猪FUT1基因的功能研究奠定基础。     

五指山小型猪DAZAP2 cDNA的克隆及其生物信息学分析

为了克隆五指山小型猪DAZ相关蛋白2(DAZAP2)cDNA全长并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法克隆得到DAZAP2全长cDNA序列,并运用生物信息学软件对其核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:五指山小型猪DAZAP2基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、苏门达腊猩猩、斑马鱼、非洲爪蟾、牛、褐家鼠等动物具有很高的相似性。DAZAP2 cDNA全长943 bp,5’非翻译区长69 bp,3’非翻译区长367 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码168个氨基酸。该蛋白的分子质量为17 311 ku,等电点为7.48。     

鸭TLR2基因的克隆、序列分析及其结构预测

参考鸡Toll样受体2(TLR2)基因序列设计6对特异引物,采用PC R方法从鸭基因组中扩增得到鸭TLR2基因全序列。结果表明:克隆的鸭TLR2基因编码区全长2 382 bp,由1个开放阅读框组成,编码793个氨基酸,其中亮氨酸为14.2%,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于I型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LR R)和Toll/IL-1R(TIR)同源区结构域;与鸡、人、猪、鼠和牛TLR2基因的同源性依次为80.0%、63.5%、61.4%、60.0%和58.4%,表明该基因是一个比较保守的基因。     

高坡猪MSTN基因多态性检测及生物信息学分析

为了研究高坡猪MSTN基因多态性和结构功能,试验采用PCR技术对MSTN基因的全部外显子进行克隆扩增,并对扩增产物进行直接测序,运用生物信息软件进行序列分析。结果表明:在MSTN基因的三个外显子中,仅在第三外显子63 bp处发现了C/T单核苷酸突变位点。该位点属于同义突变,只是引起密码子改变,所编码的氨基酸并未改变,蛋白质三级结构空间构象未发生变化。说明MSTN蛋白预测为亲水性蛋白,具有信号肽、跨膜结构,属于分泌蛋白。     

猪BST-2全基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析

为研究猪BST-2基因的生物学功能,用特异性的引物扩增猪BST-2基因,并利用生物信息学软件对猪BST-2基因及氨基酸进行分子特性分析,同时进行了猪BST-2蛋白的真核表达及组织表达谱分析。结果表明:猪BST-2基因全长851bp,其中5′-UTR为23bp,3′-UTR为294bp,CDS区为534bp,编码177个氨基酸,猪源BST-2蛋白氨基酸序列与大猩猩、仓鼠、家鼠、驴、猫、牛、猕猴、绵羊、人BST-2蛋白氨基酸序列同源性分别为46.1%,41.7%,39.5%,35.4%,42.0%,40.5%,44.4%,38.7%,46.8%。含有2个跨膜结构(27~49aa和154~176aa),2个潜在的糖基化位点,14个潜在的磷酸化位点,包含磷酸激酶ATM、CKⅡ、PKA、PKC的结合位点。构建真核质粒并转染发现猪BST-2蛋白能够在Vero细胞内正确表达。半定量PCR检测发现BST-2基因在所有组织中均有表达,尤其是在免疫组织及器官(淋巴结、胸腺、扁桃体、脾)、大肠、小肠中的表达量较高。本试验为今后进一步分析验证猪BST-2蛋白的抗病毒机制奠定了基础。     

马岗鹅TLR3基因选择性剪切体的克隆及生物信息学分析

为了研究鹅Toll样受体3(gTLR3)基因选择性剪切体在抗感染免疫中的作用,根据鸡、人和小鼠TLR3基因序列设计引物,利用RT-PCR和SMART RACE技术,首次克隆了鹅TLR3基因的选择性剪切体。所得基因序列提交GeneBank,登录号:KC292271。结果表明:核酸序列分析表明,鹅TLR3基因选择性剪切体开放阅读框长2283 bp,编码761个氨基酸,该蛋白等电点7.56,分子量为86.29 kD;与鹅、鸡、小鼠、猪、鱼、牛、羊和人的同源性分别为84.71%、74.40%、48.63%、50.38%、40.09%、50.16%、50.71%和50.98%。推导的氨基酸序列分析显示,在其胞外具有LRRs结构域,跨膜区和不完整的TIR结构域,N末端存在信号肽,且可能在26～27位氨基酸处存在裂解位点。胞外区有14个明显的LRR和15个N连接的糖基化位点。文章首次证实鹅TLR3选择性剪切体的存在,为进一步研究该基因的功能和蛋白质的特性奠定了基础。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

保山猪和杜洛克猪IGF-1基因的SNP筛选及生物信息学分析

试验旨在探究IGF-1基因单核苷酸突变位点对保山猪和杜洛克猪生长性能的影响。试验以保山猪和杜洛克猪为研究对象,采用直接测序法对IGF-1基因的多态性进行检测,利用生物信息学软件分析编码蛋白结构。结果显示：在保山猪IGF-1基因编码蛋白的外显子上共筛选出1个SNP位点（Exon4-G189A）,该突变属于同义突变,引起密码子改变,但所编码的氨基酸未改变。生物信息学分析结果显示,保山猪IGF-1基因CDS区编码164个氨基酸,分子式为C782H1265N247O239S11,相对分子质量为18303.82,理论等电点为9.89,不稳定性指数为73.25,整体表现为亲水性,不具有跨膜结构,含有信号肽序列;蛋白质二级结构只含有无规则卷曲和α-螺旋,分别占60.37%、39.63%,三级结构预测模型与保山猪IGF-1基因的蛋白结构匹配度为-1.15,具有较好的一致性。研究表明,IGF-1基因在物种进化过程中高度保守,使其编码保山猪和杜洛克猪的氨基酸序列相同,蛋白质结构和功能差异很小或不存在差异,能否作为调控保山猪瘦肉少、脂肪多、生长慢的候选基因还需进行关联性的研究。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区(CDS)序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列(登录号:NM_001163647.2)设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高(9.2%),在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域:MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

文昌鸡促卵泡素受体基因外显子区域SNPs分析

寻找与鸡繁殖性能相关的遗传标记,为高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。本研究以促卵泡素受体（FSHR）基因作为影响鸡繁殖性状的候选基因,采用PCR-SSCP技术结合测序对FSHR基因部分包括所有外显子区域进行单核苷酸多态性检测和分析。结果发现,在区域2、区域4、区域6、区域9共4个区域存在SNPs位点。exon4编码区43 bp处T→C突变,但没有导致翻译后氨基酸序列的改变,在exon2中编码区5′端—49 bp处的C→T突变;exon6 编码区3′端+12 bp处的A→G突变;exon8编码区3′端+38 bp处的 G→T突变。促卵泡素受体（FSHR）是促卵泡素（FSH）的特异性受体,这些位点的单核苷酸多态性为下一步研究探讨FSHR基因对文昌鸡繁殖性能的遗传效应奠定了基础。     

海南五指山猪Myf5与MyoD基因多态性分析

为研究海南五指山猪Myf5和MyoD基因的多态性分布情况,本试验通过PCR-RFLP方法对80头海南五指山猪进行了Myf5和MyoD基因型检测,并运用生物信息学方法对这两个基因的序列进行分析.结果发现,在Myf5基因第1外显子的HhaⅠ-RFLP位点上,五指山猪以CC和CG基因型为主;在Myf5基因第1外显子的Hsp92Ⅱ-RFLP位点上,五指山猪以AA基因型为主;在MyoD基因第1内含子的DdeⅠ-RFLP位点上,等位基因A在五指山猪中是优势等位基因.此外,Myf5和MyoD基因启动子区域和第1外显子处存在CpG岛.本研究得到海南五指山猪Myf5和MyoD基因的序列信息,为下一步五指山猪Myf5和MyoD基因的功能研究奠定基础.