Smad2基因在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中的表达分析

Smad2基因是Smads蛋白家族的成员之一,Smad家族中的信号分子对绵羊的繁殖、卵泡发育有重要影响。本实验选取24只3~4岁健康空怀敖汉细毛羊,采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学技术,测定Smad2基因在绵羊不同发情时期(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)的表达量并分析其在卵泡中表达规律。结果表明:Smad2基因m RNA和蛋白均在绵羊发情前期表达量最高,m RNA水平极显著高于乏情期、发情间期和发情期(P0.01);而发情前期蛋白水平极显著高于乏情期和发情期(P0.01),虽高于发情间期,但差异不显著(P0.05);Smad2蛋白主要在卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞以及卵母细胞表达。据此,Smad2基因可能会促进敖汉细毛羊的发情启动。     

BAD基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢表达规律及对生殖激素的影响

本实验研究旨在探究BAD基因在敖汉细毛羊中的不同发情时期卵巢中表达量的变化规律以及对生殖激素的影响,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。首先利用放射免疫方法测定敖汉细毛羊血液中促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_2)和孕激素(P_4)的浓度,然后利用qRT-PCR检测乏情期、发情前期、发情间期和发情期卵巢BAD基因的表达量变化。结果表明:卵巢中BAD基因在发情前期的表达量极显著高于乏情期、发情期和发情间期(P0.01),在发情期的表达量极显著高于乏情期和发情间期(P0.01),乏情期和发情间期的表达量基本相同(P0.05);E_2和LH浓度在BAD基因表达量最高的发情前期维持较高水平,P_4的浓度维持较低水平。综上可知,BAD基因的表达可能促进了E_2和LH浓度升高,抑制了P_4产生,进而影响细毛羊发情,可为绵羊发情的研究提供借鉴。     

转化生长因子βⅠ型受体基因在敖汉细毛羊不同组织及发情时期卵巢中的表达分析

试验旨在探究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor-beta receptorⅠ,TGF-βRⅠ)基因在敖汉细毛羊中的组织表达情况,以及在不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。以24只季节性发情的敖汉细毛羊为研究对象,分为乏情期、发情间期、发情前期和发情期4组,每组6只。首先利用实时荧光定量PCR检测其发情期甲状腺、下丘脑、垂体、卵巢、肾上腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌肉12个组织中TGF-βRⅠ基因的表达情况,其次对4个不同发情时期卵巢TGF-βRⅠ基因的表达量变化进行研究。结果显示,TGF-βRⅠ在各组织中均有表达,在卵巢和甲状腺中表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01);在下丘脑、垂体、胰腺、肾上腺、脾脏和肺脏组织表达量较高,显著高于心脏、肝脏、肾脏和肌肉组织(P0.05)。卵巢中TGF-βRⅠ基因在发情前期表达量最高,极显著高于其他3个时期(P0.01),发情间期表达量最低,极显著低于其他3个时期(P0.01)。综上所述,卵巢组织中TGF-βRⅠ基因在发情前期时可能对排卵前卵泡的成熟起促进作用。     

转化生长因子βⅠ型受体基因在敖汉细毛羊不同组织及发情时期卵巢中的表达分析

试验旨在探究转化生长因子βⅠ型受体（transforming growth factor-beta receptorⅠ,TGF-βRⅠ）基因在敖汉细毛羊中的组织表达情况,以及在不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。以24只季节性发情的敖汉细毛羊为研究对象,分为乏情期、发情间期、发情前期和发情期4组,每组6只。首先利用实时荧光定量PCR检测其发情期甲状腺、下丘脑、垂体、卵巢、肾上腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌肉12个组织中TGF-βRⅠ基因的表达情况,其次对4个不同发情时期卵巢TGF-βRⅠ基因的表达量变化进行研究。结果显示,TGF-βR Ⅰ在各组织中均有表达,在卵巢和甲状腺中表达量最高,极显著高于其他组织（P<0.01）;在下丘脑、垂体、胰腺、肾上腺、脾脏和肺脏组织表达量较高,显著高于心脏、肝脏、肾脏和肌肉组织（P<0.05）。卵巢中TGF-βRⅠ基因在发情前期表达量最高,极显著高于其他3个时期（P<0.01）,发情间期表达量最低,极显著低于其他3个时期（P<0.01）。综上所述,卵巢组织中TGF-βRⅠ基因在发情前期时可能对排卵前卵泡的成熟起促进作用。     

EphA2及EphrinA2在敖汉细毛羊皮肤中的表达及分布规律研究

本文旨在探究EphA2及其配体EphrinA2基因在细毛羊毛囊发生、发育过程中的表达与分布规律,为毛囊发育的分子调控机制提供理论基础。试验以敖汉细毛羊生长发育不同时期体侧部皮肤为材料,采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术,对EphA2和EphrinA2基因的mRNA和蛋白水平在皮肤毛囊中的表达规律进行研究。实时荧光定量PCR结果显示:EphA2和EphrinA2基因的表达量在胎龄120d时显著高于胎龄90d和出生后1d(P0.01);出生后1和30d时差异不显著(P0.05)。免疫组化结果表明:EphA2及EphrinA2蛋白在胎龄90和120d、出生后1和30d,4个时期的细毛羊体侧皮肤毛囊发育过程中,主要在毛囊、毛母质、外根鞘和表皮中表达,且呈现一定的特异性表达。综上结果表明,EphA2及EphrinA2与细毛羊皮肤毛囊形态发生、发育过程密切相关,可为相关研究提供借鉴。     

长白猪不同时期和不同组织中Smad7基因的表达研究

为了研究Smad蛋白7(Smad7)基因在长白猪不同发育阶段和组织中的表达情况,试验采用RT-PCR方法对试验猪进行检测。结果表明:在生长发育的胚胎期80天、105天(e80、e105)及出生后10天(d10)Smad7基因均有高表达,并且出生后随着时间的延长表达量越来越低,在不同器官/组织中的表达也不相同,在脾脏、肝脏、肾脏器官中高表达,而在腿肌组织中低表达。     

敖汉细毛羊Notch1基因真核表达载体的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Notch1基因表达载体及转染成纤维细胞后基因表达量变化。试验以敖汉细毛羊40日龄胎儿为研究对象,提取RNA反转录并参照Gen Bank中Notch1基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Notch1基因片段,将得到的Notch1基因片段连接至pGM-T载体,构建pGM-T-Notch1克隆载体并转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定后构建pcDNA3.1-Notch1重组表达载体,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞。将敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-Notch1瞬时转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术检测Notch1基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Notch1构建成功,并且转染成纤维细胞后Notch1基因的表达量升高,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。结论:成功构建了敖汉细毛羊Notch1基因的表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因表达量明显升高,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

东北细毛羊发情和排卵规律的研究

本实验系统观察了东北细毛羊的繁殖季节开始时间、发情周期长度、发情持续时间、排卵时间及早期胚胎发育进程等。结果表明：（１）在黑龙江地区大多数（７０．３％）东北细毛羊于７月２１日至８月９日开始发情季节，也即于夏至后１个月至５０ｄ内开始发情；（２）发情周期平均长度１６．６３±０．８４ｄ，８０％的羊为１６～１７ｄ，方差组分估计和Ｆ检验判断，发情周期长度在羊个体间和个体内的差异均不显著；（３）平均发情持续时间３８．３４±１３．７３ｈ，８５％的羊为２４～４８ｈ，方差组分估计和Ｆ检验证明，发情持续时间的个体差异显著且个体间差异显著大于个体内差异；（４）发情开始后２６～３５ｈ排卵；（５）发情５１ｈ胚胎处２．细胞期，６６～７２ｈ处４～６细胞期，７６～８１ｈ处８－细胞期。     

敖汉细毛羊Noggin基因质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本实验旨在构建敖汉细毛羊Noggin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Noggin基因mRNA及蛋白表达量的变化。实验以40日龄胎羊为研究对象,采集组织样品,通过PCR反应扩增目的基因片段,经切胶回收后连接到pEM-T1载体,构建pEM-T1-Noggin后转染到大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取pEM-T1-Noggin后进行酶切鉴定。鉴定后符合标准即可构建pcDNA3.1-Noggin重组表达载体,转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养,将重组质粒pcDNA3.1-Noggin转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Noggin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-Noggin表达载体构建成功,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染组的mRNA及蛋白表达量均极显著高于对照组。本研究在细胞水平上验证了Noggin基因功能,为进一步在个体水平上研究Noggin基因功能奠定基础。     

牦牛PLIN2基因的克隆及其在卵巢不同发情阶段的表达

试验旨在研究牦牛PLIN2基因的序列特征和表达特性,并分析其表达与不同发情时期的卵巢的相关性。根据GenBank中已知的普通牛序列,设计克隆引物,经RT-PCR扩增得到牦牛PLIN2基因序列。RT-PCR检测PLIN2基因在各个组织中的表达量,实时荧光定量PCR分析卵巢不同发情时期的表达量。结果表明,牦牛PLIN2基因的编码区长为1 353 bp,共编码450个氨基酸,为无跨膜结构的非分泌蛋白。与GenBank中已知的普通牛序列同源性达到99.4%,表明PLIN2基因在进化过程中相当保守。在牦牛的各个组织中PLIN2分布广泛,但不同组织中的表达有差异,卵巢、乳腺、胃和肾脏中相对较多,而肺脏中几乎没有表达。实时荧光定量PCR结果显示,在卵巢的不同发情时期PLIN2都有表达,且在黄体期的表达量最高,表明PLIN2基因在牦牛发情周期中起着不可忽视的作用。     

DKK2基因质粒的构建及其在敖汉细毛羊成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在探究DKK2基因过表达后在敖汉细毛羊成纤维细胞中的表达量变化.采集40日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织作为实验样品,首先参照GenBank中绵羊的DKK2基因序列信息进行引物设计,通过PCR反应对DKK2基因进行扩增,并与pGM-T载体进行连接反应,构建了pGM-T-DKK2重组质粒;将克隆载体转化DH5α大肠杆菌...     

Bcl-2和Bax在不同发情时期小鼠子宫中的表达

利用免疫组织化学和RT-PCR等方法,分别检测了凋亡调节基因Bcl-2和Bax在不同发情时期及超排处理后的小鼠子宫中的表达情况,并进行了分析。1材料与方法1.1主要器材与试剂PCR仪(美国MJ公司),电泳仪(北京六一厂),紫外分光光度仪(美国pharmacia公司),免疫组织化学所有的一抗为兔抗小     

绵羊CS-1基因的克隆及在凉山半细毛羊不同组织中的表达

旨在研究绵羊CS-1基因序列及其蛋白质的结构与功能以及其在不同组织中的表达情况,进而预测其与肉质性状的关联性.Calsarcins(Calcineurin-associated sarcomeric protein,CS)家族是一个与钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)相结合的肌纤维特异表达蛋白新成员,CS-1基因是与畜禽肉质性状密切相关的重要候选基因.本研究根据牛、人和鼠CS-1基因mRNA,应用比较基因组学技术成功克隆了绵羊CS-1基因全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行生物信息学分析.结果显示,该基因cDNA全长951 bp,完整的开放阅读框(ORF)为79～872 bp,编码264个氨基酸.氨基酸序列中存在3个保守结构域,蛋白质二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,富含疏水区,存在多个磷酸化位点和1个蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)的磷酸化位点.通过实时荧光定量RT-PCR技术分析CS-1基因在凉山半细毛羊部分组织中的表达情况.结果表明:CS-1基因主要在凉山半细毛羊的心脏和背肌中表达,15 d在心脏的表达量最高,极显著高于其它各组织(P＜0.01);在心脏和背肌中,CS-1基因的表达量随着年龄的增长而减少,其中在60 d时心脏中的表达量最高.研究结果为绵羊的肉质性状改善提供科学依据.     

凉山半细毛羊IGF-Ⅰ基因的表达规律研究

试验采用Real time PCR技术研究了IGF-Ⅰ在绵羊不同组织的各个时间点的表达.结果表明:5个组织在105 d时出现第一个表达拐点,15 d→105 d时肌肉、大脑和肝脏组织的表达降低后再升高,而皮肤和心脏组织在15 d和60 d时的表达无显著差异,105 d时才显著或极显著升高;105 d后,肝脏组织的表达逐渐降低,肌肉、心脏、大脑和皮肤组织在195 d时出现第2拐点,但肌肉和心脏组织并未引起表达的显著差异,而大脑和皮肤组织在195 d时的表达显著高于150 d和240 d,揭示IGF-Ⅰ基因在5个组织的表达具有一定的同步性.为凉山半细毛羊的生长调控机理提供了理论依据.     

敖汉细毛羊Hoxa5基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Hoxa5基因的质粒及转染成纤维细胞后基因的表达量变化。试验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照Gen Bank中Hoxa5基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5基因片段、将得到的Hoxa5基因连接到pGM-T载体,构建pGM-T-Hoxa5重组质粒并转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3. 1-Hoxa5重组质粒,转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3. 1-Hoxa5转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3. 1-Hoxa5构建成功,并且转染成纤维细胞后Hoxa5基因的表达量明显升高,且转染组的表达量显著地高于对照组(P 0. 05)。表明:成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

敖汉细毛羊不同部位皮肤毛囊发育及形态结构研究

本实验旨在探究敖汉细毛羊毛囊的组织结构与形态发生过程,为细毛羊毛囊发育的分子调控机制研究奠定组织学基础。分别采集胎龄第90、120天的胎儿及出生后1 d和30 d的羔羊体侧部(多毛区)和腹股沟部(少毛区)皮肤组织,制作纵、横切片并显微观察。结果表明:敖汉细毛羊毛囊结构包括结缔组织鞘、外根鞘、内根鞘、毛干和毛球部;在胎龄90 d时,体侧部初级毛囊可见皮脂腺原细胞及次级毛囊毛芽,在胎龄120 d时,毛囊形成角质化毛干并穿出体表,再分化次级毛囊发生;出生后1 d和30 d时,穿出体表毛干进一步增多,体侧部初级毛囊密度,在胎龄120 d时低于胎龄90 d时(P0.01),出生后1 d时低于胎龄120 d时(P0.05),次级毛囊密度,在胎龄120 d时高于胎龄90 d时(P0.01),出生后1 d时低于胎龄120 d时(P0.01),出生后1 d和30 d时差异不显著(P0.05),S/P比值,在胎龄120 d时高于胎龄90 d时(P0.01),生后30 d时高于出生后1 d时(P0.01),对腹股沟部皮肤分析显示,其毛囊密度很低。结果可为了解细毛羊毛囊形态结构变化及筛选与毛密度相关的差异基因提供参考依据。     

敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体的构建及在成纤维细胞中的表达

为了构建敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体以及研究表达载体转染成纤维细胞后基因表达量的变化,试验从40日龄敖汉细毛羊肩部皮肤提取RNA并反转录成cDNA,参照GenBank中Hoxa7基因的CDS区序列设计1对引物;将PCR扩增获取的Hoxa7基因CDS片段连接到pEASYTM-T1载体上,构建pEASYTM-T1-Hoxa7克隆载体,将克隆载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;从pEASYTM-T1载体上切下Hoxa7基因片段,连接到pcDNA3.1表达载体上,再次转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;将重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7瞬时转染到传代的成纤维细胞中,利用实时荧光定量PCR技术、Western-blot方法检测成纤维细胞中Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达情况。结果表明:重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7构建成功;瞬时转染到成纤维细胞中后, Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达量均极显著升高(P0.01)。说明敖汉细毛羊Hoxa7基因在成纤维细胞中能够高效表达。