偏肿革裥菌研究进展

对白腐菌偏肿革裥菌的命名,培养特性,木质素降解酶系统的活性检测,产酶发酵条件的优化,酶的纯化与酶学性质,对木材和木质素的分解能力,对染料和有毒物质的降解作用,木质素降解酶基因的克隆、结构与表达量分析,转录组构建与差异表达基因分析,转录因子等方面的研究进展进行系统地回顾,为进一步研究与开发偏肿革裥菌提供参考.     

偏肿革裥菌降解木质素关键基因挖掘

通过对白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)在木质和非木质环境下的转录组进行测序,从而预测和筛选出L.gibbosa与木材降解有关的基因。采用高通量测序技术对木屑和非木屑处理条件下的菌丝样本进行转录组测序。利用eggNOG、GO等数据库注释方法对转录本进行比较分析,预测和筛选出L.gibbosa与木材降解有关的基因。L.gibbosa转录组测序两组试验组分别设置3个生物学重复样本,共得到6个样本42.71 Gb Clean Data,各样品Clean Data平均达到7.11 Gb,各样品的Reads与参考基因组的比对效率在88.51～91.37%。差异表达分析得到差异表达基因1 120个,其中上调370个,下调750个。差异基因被注释到GO数据库的有493个,注释到eggNOG数据库的有857个。eggNOG分析表明,差异基因表达多聚集在翻译后修饰、蛋白质折叠、蛋白分子伴侣;碳水化合物的运输和代谢;能量产生和转化;次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢等功能分类下。GO分析表明,显著性富集与频率较高的生物过程是氧化还原过程、氧化还原酶活性和木质素代谢过程。L.gibbosa降解木材与木质素分解代谢过程(GO:0046274)、氧化还原过程(GO:0055114)和氧化还原酶活性(GO:0016491)等3个基因本体功能类目密切相关。根据基因功能注释的结果得到7个与白腐菌降解木质素相关的重要差异表达基因。     

茜素红诱导下偏肿革裥菌SSH-cDNA文库构建与差异表达基因筛选

为了探索白腐菌偏肿革裥菌降解染料茜素红过程中的生理机制和差异表达基因,在LNAS培养基上培养菌株,以添加茜素红为处理组,加入无菌水为对照组,采用抑制性消减杂交方法构建了在染料降解过程中的差异基因cDNA文库。经过2次差减杂交后所得的阳性克隆,除去重复序列后得到75个独立基因的ESTs序列,即为差异基因的SSH-cDNA文库。文库中显著表达的差异基因主要有编码谷氨酰胺合成酶、热激蛋白70、ɑ,β-水解酶、脯氨酰氨肽酶-2、MFS普通基质转运蛋白、钙网结构域蛋白、20S蛋白酶体亚基α型3、3-脱氧-7-磷酸庚酮糖合酶、醛酮还原酶、脂肪酸2-羟化酶、辅酶Ⅰ黄素氧化还原酶、细胞色素P450等基因,这些差异基因及其产物参加了茜素红的氧化降解反应、糖类和蛋白质的降解作用、应激反应和信号转导途径。此研究结果可为进一步筛选偏肿革裥菌中与染料降解性状相关的基因奠定基础。     

偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.     

偏肿革裥菌C2H2型锌指基因表达分析

C2H2型锌指转录因子在植物、动物和部分真菌的生长发育过程中发挥着重要的作用,但其在偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)中的作用尚不清楚.通过对木屑处理后不同时期的偏肿革裥菌菌丝进行提取和转录组分析,为偏肿革裥菌在营养基质条件下菌丝的生长研究提供支持.运用COG、GO和KEGG数据库进行注释分析,筛选出与偏肿...     

茜素红处理下偏肿革裥菌细胞色素P450基因表达分析

用蒽醌类染料茜素红在0(ck),3(QSH1),7(QSH2),10 h(QSH3)分别处理白腐菌偏肿革裥菌,构建转录组,为研究白腐菌的细胞色素P450(CYP450)基因在脱色降解茜素红机制中的作用提供理论支持。采用高通量测序技术对茜素红处理下的菌丝样本进行转录组测序,利用功能注释筛选出CYP450基因。结果表明:4个转录组共得到26.17 Gb的有效数据,与参考基因组的比对效率为71.23%～73.66%,通过功能注释搜索所有基因,共得到96个CYP450基因。通过ck与QSH1、ck与QSH2、ck与QSH3的分组比较,对所有的CYP450基因进行差异表达筛选。其中,有3个基因(gene₂4255、gene₁8992、gene₇490)在3组对比中都出现。将这3个基因的0～10 h的表达量与茜素红脱色率进行比较,得出这3个基因的表达量与脱色率呈正相关。通过对KEGG通路进行分析,发现gene₂5488被注释到芳香化合物降解通路,初步印证了CYP450基因可能参与了偏肿革裥菌对茜素红染料的脱色。...     

偏肿革裥菌C2H2型转录因子SFP1基因克隆、生物信息学及表达分析

以L.gibbosa菌丝体总RNA反转录的cDNA为模板,通过RT-PCR克隆得到一个C2H2型锌指转录因子的cDNA序列。对该基因进行基因克隆、生物信息学分析,并利用实时荧光定量法对木屑处理下该基因的表达进行分析。通过保守结构域预测与结构分析发现该基因为裂指蛋白1类(SFP1)C2H2型锌指转录因子,具有2个C2H2家族的保守结构域,将该基因命名为Lg-sfp1。该基因CDS全长1 947 bp,编码一个由648个氨基酸组成的亲水性膜内蛋白,蛋白大小为68.27 ku。通过SWISS-MODEL预测的三级空间结构发现两个完整的C2H2结构。木屑处理下Lg-sfp1基因表达比无木屑处理下表达量低,推断木屑促进了L.gibbosa氧化应激反应,当氧化应激反应大量发生时,参与氧化应激反应负调控的sfp1基因表达受到抑制,为后续研究偏肿革裥菌sfp1基因在木材降解,特别是氧化应激反应中的功能提供了理论基础。     

偏肿革裥菌Lg-mnp1基因克隆及表达研究

[目的]研究偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况.[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物,采用PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834）,进行蛋白序列分析,并通过双酶切的方法获得重组质粒,将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达.[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因,命名为Lg-mnp1.蛋白序列分析表明Lg-MnP1含有4个二硫键属于短MnP,预测成熟蛋白分子量为35.94kD,pI为4.43.通过双酶切的方法将Lg-mnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上,获得重组质粒pPICZB/%-mnp1,转化子经PCR验证后,在BMMY培养基中甲醇诱导培养,在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L,表明Lg-mnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达.[结论]该方法对偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况进行研究,为偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的进一步应用提供了依据.     

偏肿革裥菌 MnP基因在构巢曲霉中转化方法的建立1）

对已经构建好的携带有白腐菌偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）锰过氧化物酶完整编码序列基因的载体质粒pMDTM18-T/Lg-mnp、以及整合型表达载体质粒pLB01分别双酶切,然后进行连接构建了重组质粒pLB01/Lg-mnp。对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）尿嘧啶尿苷营养缺陷体菌株TN02A7进行了制备分生孢子原生质体酶解方法的摸索。结果表明：将溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶3种酶以1∶1∶1的比例混合,能有效地使构巢曲霉的分生孢子形成原生质体。采用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法成功地将L．gibbosa的MnP基因转入到了构巢曲霉中,获得了携带有白腐菌基因的构巢曲霉转化子菌株。     

偏肿革裥菌系统发育与Lg-mnp2和Lg-mnp3基因克隆及结构特征

白腐菌偏肿革裥菌Lenzites gibbosa能分泌降解木质素的锰过氧化物酶(MnPs),为进一步鉴定试验菌株,对菌株L. gibbosa CB1进行了ITS序列(Gen Bank登录号为JF279440)扩增与测序,并进行了基于ITS序列的比对与系统发育分析,结果表明CB1与桦革裥菌L. betulina和栓菌属Trametes等相关白腐菌的亲缘关系较近而聚类在一起,并与24个同种其他菌株的ITS序列覆盖度在85%～97%期间内的相似性都为99%,说明该菌株为偏肿革裥菌。为了获得该菌株多个编码MnP家族的基因,从而为研究MnP基因的表达调控奠定序列结构的基础,根据已知白腐菌MnPs基因保守区和已经扩增出的基因片段设计引物,以L. gibbosa CB1的基因组DNA和总RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆到该菌株编码MnP2和MnP3的全长c DNA和DNA基因(Gen Bank登录号分别为JQ388597、JN571114; JQ411249、JN571116),分别命名为Lg-mnp2和Lg-mnp3。2个基因DNA全长分别为2 869、3 992 bp,都含有6个外显子和5个内含子;其启动子区域都含有TATA-Box、CAAT-Box、AP2、MRE等顺式作用元件,Lg-mnp2还含有AP1,Lg-mnp3还含有HSE;其c DNA基因分别含有50、52 bp的5'UTR,150、249 bp的3'UTR和1098、1 101 bp的完整开放阅读框ORF,分别编码了365、366个氨基酸的蛋白质多肽前体(Gen Bank登录号分别为AFC37493、AFC37494),成熟的Lg-mnp2蛋白含有339个氨基酸,比Lg-MnP1蛋白(Gen Bank登录号为ACO92620)多1个氨基酸;成熟的Lg-mnp3蛋白含有340个氨基酸,比Lg-MnP2蛋白多1个氨基酸。     

铜胁迫下的西瓜食酸菌转录组分析

【目的】分析西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)在铜胁迫下转录水平的响应特征,研究对其抗铜系统和抗铜机制,为进一步解析西瓜食酸菌的铜耐受分子机制积累数据。【方法】以西瓜食酸菌亚群I的抗铜菌株FC440铜胁迫和无胁迫培养下的菌体为材料,提取RNA并利用RNA-Seq技术获取细菌对铜胁迫的应答数据,分析数据质量、差异表达基因的类型、KEGG富集与Pathway注释、GO富集分析等转录组水平特征,并进行qPCR验证。【结果】共获得6个转录组文库,总数据量23.6 Gb;该细菌共有4 344个基因表达,其中有466个基因差异表达(上调266个,下调200个);差异表达的基因显著富集于ABC转运系统的跨膜转运、双组分系统通路的信号转导以及氨基酸代谢等约9大通路;基因表达趋势与转录组测序数据的趋势一致。【结论】铜胁迫下谷氨酸、谷胱甘肽等氨基酸代谢在西瓜食酸菌抗铜胁迫中发挥重要作用;双组分系统参与西瓜食酸菌对铜离子胁迫的响应且受到负调控;该菌中可能存在包含ABC转运体的跨膜转运、氧化还原反应、胞内束缚沉淀等多种系统互作的抗铜机制。     

干旱处理下2个梨品种转录组差异表达基因分析

【目的】以转录组数据为基础挖掘梨抗旱关键基因,为培育梨抗旱品种提供理论基础。【方法】以正常浇水和干旱处理下黄冠梨Pyrus bretschneideri‘Xuehuali’×P.pyrifolia‘Shinsseiki’和黄金梨P.pyrifolia‘Niitaka’×P.pyrifolia‘Nijisseiki’的叶片进行Illumina Hi Seq TM 2000高通量转录组测序分析,利用基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析2个梨品种中的差异表达基因(DEGs)。【结果】2个梨品种间在正常浇水和干旱处理下分别发现了4 377和3 841个DEGs,其中只在干旱处理下的DEGs有1 340个。这些DEGs在GO数据库的3个本体生物过程、分子功能和细胞成分中富集到的数量分别是1 387、922和1 253个,与植物抗旱相关的代谢过程、应激反应和生物膜等条目分别富集到349、139和151个DEGs。仅在干旱处理下的1 340个DEGs被比对到102个KEGG代谢通路上,其中与植物内源激素相关的代谢通路有3个。将1 340个DEGs进行转录因子分析发现,被注释为转录因子的有37个,分布在17个转录因子家族中,其中乙烯应答转录因子(ERF)家族所拥有的DEGs最多,为11个。【结论】本研究发现了与梨抗旱相关的内源激素代谢基因和转录因子,干旱胁迫下这些基因在2个梨品种中差异表达,这可能与2个品种的抗旱性差异存在密切关系,为下一步梨抗旱分子机理研究奠定了基础。     

AaMcm1基因调控链格孢菌丝生长的转录组初步分析

MADS box转录因子是生物体中重要的结合型转录因子,属于SRF型的Mcm1基因已被证实在多种真菌中发挥重要作用.本课题组前期对链格孢菌中的AaMcm1基因进行敲除,得到了生长速度严重下降的突变体,通过对该突变体及野生菌进行转录组研究,发现有1917个基因表达上调,1322个基因表达下调,GO分析表明上调基因参与了4...     

尖孢镰刀菌侵染枸杞根系的转录组分析

由尖孢镰刀菌引起的根腐病是枸杞种植中的主要病害之一,为探究尖孢镰刀菌侵染枸杞的分子致病机制,并挖掘其关键致病基因,通过尖孢镰刀菌侵染‘宁杞1号’枸杞根系,于侵染第7天刮取菌样进行转录组测序分析。结果表明,与纯培养菌株相比,在侵染第7天的尖孢镰刀菌中共发现了1 892个显著差异表达基因,其中上调表达基因1 242个,下调表达基因650个;GO富集分析表明,分子功能分类的跨膜转运蛋白和ATP酶活性以及生物学过程分类的跨膜转运可能在尖孢镰刀菌致病过程中发挥了重要作用;KEGG富集分析表明,鞘脂代谢、过氧化物酶体和ABC转运蛋白是尖孢镰刀菌侵染过程的主要代谢途径。此外,通过对比分析编码碳水化合物酶与植物-病原互作相关基因在尖孢镰刀菌侵染前后的表达量,筛选到10个关键致病候选基因。     

红橘响应褐斑病菌侵染的转录组学分析

【目的】明确红橘(Citrus reticulata Blanco, cv. Hongjv)接种褐斑病致病菌——链格孢菌橘致病型(Alternaria alternata tangerine pathotype)后基因种类和表达量在转录水平的变化规律,确定红橘响应该致病型侵染的关键基因。【方法】采用链格孢菌橘致病型接种红橘离体叶片,28 h后选取感病叶片和未接种叶片提取RNA,进行转录组高通量测序,然后利用生物信息学分析,以甜橙基因组为参考,以|log2 fold change|≥1,q-value≤0.01为阈值选取感病和健康红橘叶片转录组的差异表达基因,应用GO数据库对差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)进行功能分类,KEGG分析代谢途径,MapMan软件分析生物胁迫信号通路相关基因的表达变化。采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。【结果】红橘接种链格孢菌橘致病型28 h后产生大量与胁迫相关的差异表达基因,获得上调差异基因5 173个,下调差异基因6 555个。GO功能分类显示差异基因主要与蛋白结合、膜、氧化还原过程等相关。通过KE...     

大豆PP2C家族基因鉴定与响应盐胁迫的转录组分析

植物蛋白磷酸酶2C(PP2C)能够通过影响植物体内多种生物学过程在环境胁迫响应中发挥重要作用.为研究栽培大豆PP2C家族成员在盐胁迫中的功能,通过生物信息学手段结合转录组学分析对栽培大豆PP2C家族进行了系统探究.在栽培大豆中共鉴定出126个PP2C家族成员,并将其在进化树上分为11个亚家族,同一亚家族的成员具有类似的...     

干旱胁迫下花生转录组与miRNA测序及相关基因的表达

[目的]探明干旱胁迫下花生转录组与miRNA测序及相关基因的表达,为深入分析花生抗旱分子机制提供理论依据.[方法]采用转录组测序和miRNA测序技术,对桂花37花生在15％ PEG6000模拟干旱胁迫下基因和miRNA的表达模式进行分析.[结果]转录组测序发现有13个显著持续上调的差异基因,其中7个为HSP分子伴侣家族...