小麦遗传转化中潮霉素筛选体系的建立及应用

为建立小麦遗传转化中高效的潮霉素筛选体系,以小麦品种郑麦9023的幼胚愈伤组织为材料,探讨了潮霉素浓度、处理时间、恢复培养与否对愈伤组织分化和再生的影响,并对基因枪转化的郑麦9023、邯6172、龙麦30、龙麦31的愈伤组织进行了筛选。结果表明,对小麦幼胚愈伤组织基因枪遗传转化后的筛选以50mg·L-1潮霉素处理30d为宜;恢复培养不能提高筛选阶段愈伤组织的存活率和分化率,但能提高转化后期的成苗率。经过筛选发现郑麦9023抗性愈伤和T0代抗性植株根系及花器官中均有GUS基因的表达;4个小麦品种抗性植株中潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和候选基因PCR阳性率分别为78.95%和73.68%以上;龙麦30、龙麦31的T1代植株的候选基因PCR阳性率分别在33.33%和73.33%以上,T2代阳性率分别在71.43%和75.00%以上。     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复系转基因体系的研究

以适宜在长江中下游地区栽培的甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复系为遗传转化受体,建立根癌农杆菌介导的具柄子叶转化体系,转化质粒ｐＧＶ３８５０Ｈｙ∷ｐＫＵ３ 的ｈｍ ｒ（潮霉素抗性）基因和玉米自主转座因子Ａｃ（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）。结果表明,影响转化的因素包括受体基因型、培养基、植物生长调节剂的浓度等。在以潮霉素作筛选压筛选转化体之前,具柄子叶需预培养６ｄ,７０μｍ ｏｌ／Ｌ ＡｇＮＯ３ 可促进转化再生。ＰＣＲ分析结果表明获得了具有潮霉素抗性基因的转基因油菜植株     

抗生素对亚麻下胚轴愈伤诱导及芽分化的影响

研究了抗生素对亚麻下胚轴愈伤诱导及芽分化的影响。结果表明:在以潮霉素为抗性选择剂时,低浓度潮霉素已严重抑制愈伤的形成,25 mg/L的潮霉素为亚麻下胚轴愈伤形成及芽分化的较合适筛选浓度;在以氨苄青霉素、头孢霉素和羧苄青霉素为抑菌抗生素时,不同浓度抗生素对亚麻下胚轴愈伤及芽分化产生的影响不同,羧苄青霉素浓度大于300 mg/L时,对亚麻下胚轴的分化产生抑制,氨苄青霉素和头孢霉素浓度大于500 mg/L时,对亚麻下胚轴的分化产生抑制。在3种抗生素中,选择氨苄青霉素作为农杆菌介导转基因的脱菌抗生素,浓度为300mg/L时,已有很好的抑菌效果。     

卡那霉素在小麦愈伤组织遗传转化中的应用

为建立利用卡那霉素筛选的小麦遗传转化的有效体系,采用不同浓度的卡那霉素对小麦品种的幼胚愈伤组织进行处理,系统地研究了不同品种、不同愈伤组织诱导培养基、不同诱导培养时间下愈伤组织对卡那霉素筛选的反应。结果表明,不同小麦品种的愈伤组织对卡那霉素的抗性存在显著差异;同一品种不同培养条件下产生的愈伤组织对卡那霉素的反应存在显著差异;小麦品种河农827在N培养基上诱导培养14d得到的愈伤组织在含有15mg.L-1卡那霉素的分化培养基上筛选,效果较好。基因枪介导转化河农827的愈伤组织,用卡那霉素筛选得到的抗性再生苗经PCR检测,检测出12.5%的阳性株。     

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。     

根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究

为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素。结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等。实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体。菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高。在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%。在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%。     

农杆菌介导短柄草遗传转化体系的建立

为了探索短柄草的遗传转化体系,以二倍体短柄草ABR 6为受体材料,通过对诱导培养基类型、潮霉素筛选浓度和根癌农杆菌侵染浓度等参数的优化,建立了农杆菌介导短柄草遗传转化体系。结果表明,来源于未成熟胚的胚性愈伤组织在LS培养基上诱导率最高,达76.27%,最佳Hpt筛选浓度为40 mg·L^-1,最佳农杆菌侵染浓度为OD₆₀₀=0.6,在此条件下ABR 6的转化效率可达5%;通过PCR检测12株抗性植株,发现7株能扩增出Hpt基因（845 bp）条带;通过荧光显微镜观察转基因植株叶片,发现绿色荧光蛋白的表达,进一步证实了转基因植株的可靠性。     

马铃薯品种‘并薯6号’遗传转化体系的建立

以马铃薯品种‘并薯6号’无菌试管苗茎段作为外植体,通过对遗传转化过程中预培养时间、植物激素的种类及配比、筛选剂浓度和抗生素的种类及浓度进行研究,初步建立了马铃薯品种‘并薯6号’的愈伤再生转化体系。结果表明,预培养时间为2 d时,愈伤组织诱导率、出苗率及转化频率最高。最适外植体愈伤组织诱导的培养基配方为MS+2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.5 mg/L 2,4-二氯苯酚代乙酚(2,4-D)+0.4 mg/L激动素(KT),愈伤组织的诱导率为86.7%,愈伤组织形态较紧密,为深绿色,茎段两端膨大呈哑铃状,表面的白色须状物和毛状根较少。最适愈伤组织分化的培养基配方为MS+1 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+1 mg/L赤霉素(GA_3)+1 mg/L玉米素(ZT),幼苗比较粗壮,长势良好。最适的植株再生及生根筛选剂为10 mg/L的潮霉素(Hygromycin B,Hyg),转化频率较高,为20.3%。农杆菌抑制剂的最适浓度为200 mg/L的特美汀(Timentin,TMT),且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入TMT。综上所述,通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个因素的研究,初步建立了‘并薯6号’的遗传转化体系,为马铃薯分子育种发展提供一定的基础。     

广东丰顺县青蒿产业化发展现状与对策

以剑麻无菌苗叶片为试材,研究了潮霉素(Hyg)、菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(As)及羧苄青霉素(Car)等因素对剑麻遗传转化的影响。结果表明,剑麻最适遗传转化体系为：Hyg选择浓度为25 mg/L,OD600＝0.6左右的农杆菌菌液,侵染时间为10～15 min,As浓度为200 μmol/L,Car浓度为400 mg/L。     

油菜素内酯应用于甘蔗组织培养快繁的研究

为了研究油菜素内酯（brassinolide, BL）对甘蔗组织培养的影响,本研究以“植物器官从头再生”“体细胞胚再生”2种组培快繁体系为基础,通过添加适宜浓度的2,4-表油菜素内酯（2,4-epibrassinolide, 2,4-EBL）于基础培养基中,设计了6套适用于甘蔗快繁的组合培养基方案。并于不同诱导阶段（不定根诱导、愈伤组织诱导、成苗诱导）对接种材料的形态特征及内源植物激素（油菜素内酯、玉米素核苷、生长素、脱落酸）的含量变化进行了统计与测定,探讨了油菜素内酯应用于甘蔗组织培养快繁技术的可行性。结果表明,将不定根培养基MS + 0.2 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L LFS与成苗培养基MS + 0.5 mg/L KT +（0.2 mg/L IBA / 0.2 mg/L 2,4-EBL）+ 300 mg/L Pro进行组合,为甘蔗组培快繁的较优方案,油菜素内酯可应用于甘蔗组织培养快繁技术,且体细胞胚再生成苗优于愈伤组织再生成苗,成苗时间可缩短至32 d。     

黄皮白肉火龙果快繁体系的建立

黄皮白肉火龙果,又名麒麟果,为建立其快繁体系,本研究选取种子萌发长出的茎段为外植体,研究其不同消毒时间、不同浓度激素配比对其愈伤组织及芽的诱导、增殖继代、根生长的影响。结果表明:用无水乙醇灭菌40 s后,再用5%次氯酸钠溶液灭菌10 min,种子萌发率最高可达97%。愈伤组织及不定芽诱导培养基最佳配方为1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA,芽的诱导率最高可达97%;利用MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA培养基进行增殖、继代培养的效果最佳,增值系数最高为4.6;在MS培养基中添加2.0 mg/L IBA,可最大程度地促进根的生长。      

澳洲坚果不同外植体愈伤组织诱导与不定芽增殖研究

以澳洲坚果品种'H2'的幼嫩茎段和种子为材料,获取腋芽、子叶和上胚轴等外植体,开展愈伤组织诱导及不定芽增殖研究,再通过石蜡切片法对不同愈伤组织的细胞结构进行观察,分析比较不同外植体诱导的愈伤组织性质与不定芽分化效果.结果表明:适合腋芽愈伤诱导和分化的培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT,腋芽...     

ALA对刺葡萄愈伤组织生长及主要抗氧化物质积累的影响

以刺葡萄红色愈伤组织为材料,研究不同浓度ALA处理对刺葡萄愈伤组织生物量及主要抗氧化物质（黄酮类化合物、原花青素和花色苷）积累量的影响,明确ALA与刺葡萄愈伤组织生长、主要抗氧化活性物质合成的相关性。结果表明：中低浓度（0.05~1.0 mg/L）ALA可促进刺葡萄愈伤组织生长,显著增加刺葡萄愈伤组织的生物量;同时,中低浓度ALA能显著增加刺葡萄细胞中黄酮类化合物、原花青素和花色苷的含量;高浓度（2.0~5.0 mg/L）ALA会抑制刺葡萄愈伤组织生长,并最终导致褐变死亡;刺葡萄愈伤组织主要抗氧化物质积累也存在显著的培养阶段差异,在ALA最适浓度0.05 mg/L时,刺葡萄细胞中黄酮类化合物含量最高可达272.48 μg/g（培养45 d）、花色苷含量最高达107.24 μg/g（培养35 d）、原花青素含量最高达1630.16 μg/g（培养45 d）。由结果可知,ALA可以定向调控刺葡萄愈伤组织细胞中主要抗氧化物质的生物合成。     

玉米自交系郑58和丹340幼胚再生体系的建立

研究选取9个优良玉米品种的自交系,以幼胚为外植体,以N6、MS培养基为基本培养基,诱导愈伤组织,探讨基因型、培养基类型、外植体大小、激素浓度等因素对愈伤组织诱导率的影响,分析不同基因型愈伤组织生长状态的差异,对诱导成功的愈伤组织进行分化和再生。研究结果表明,基因型对愈伤组织诱导率起决定作用,且基因型和培养基之间存在相互作用;外植体大小在1.5～2.0 mm时的幼胚较适合诱导胚性愈伤组织;2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导形成起关键作用,浓度在2.0～2.5 mg/L时大多能诱导出胚性愈伤组织。     

椰乳在甘蔗组培快繁中作用的研究

以种性优良但组培分化斟难的3个甘蔗品种FN95-1702、FN99-2308和FN99-20169的愈伤组织为材料,以2种常用的培养基为基本培养基,分别添加4种不同体积的椰乳,采用随机区组实验设计,进行分化阶段和生根阶段培养,并对移栽幼苗成活率进行了观察.结果表明:对于不同激素配方的培养基,在分化阶段添加椰乳后甘蔗愈伤组织的分化率和芽长势均明显提高,添加椰乳的适宜体积为10%～20%,其中,以15%为最佳添加体积,可使分化率提高100%.幼苗生根阶段,添加椰乳使幼苗生根的数量减少,对移栽成活率影响不明显.不同甘蔗品种适合的培养基略有差异,实验所选用的2种培养基与椰乳之间无交互作用.     

玉米自交系GS01愈伤组织的诱导及植株再生

实验用玉米自交系GS01的幼胚作为外植体,探讨不同培养基、不同蔗糖浓度和不同2,4-D浓度等对GS01愈伤组织诱导的影响,经过继代培养筛选出胚性愈伤组织,使之分化、生根和出苗,成长为完整的植株。实验表明:玉米自交系GS01在N6培养基、2,4-D浓度为1mg/L、蔗糖浓度为30g/L时的胚性愈伤组织诱导率最高。     

玉米幼胚培养及植株再生的研究

以不同玉米自交系幼胚为外植体,研究不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导、6-BA浓度对愈伤组织分化和6-BA与NAA配合使用对试管苗生根的影响。结果表明:不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导率影响差异不明显,但对胚性率诱导有明显影响,其诱导最佳培养基为MS+2,4-D 2 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+脯氨酸500 mg/L;愈伤组织分化的最佳培养基是MS+6-BA0.5 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+谷氨酰胺200 mg/L+PP₃₃₃ 2 mg/L;试管苗生根的最佳培养基是1/2 MS+6-BA0.5 mg/L+NAA2.0 mg/L+PP₃₃₃ 2.0 mg/L+活性炭0.2%。     

贵港报春苣苔的叶片组培与植株再生

以贵港报春苣苔的叶片为外植体,研究不同培养基对其不定芽诱导和增殖、愈伤组织诱导与分化以及生根的影响。结果表明,外植体叶片以纵切为宜,不定芽诱导最适培养基为MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L,愈伤组织诱导最适培养基为MS+6-BA3.0～5.0 mg/L+2,4-D0.5～1.0 mg/L,不定芽诱导率以及愈伤组织诱导率均为100.00%;愈伤在MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培养基上分化系数达12.64;不定芽在MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培养基的增殖系数为8.55;不定芽在3/4 MS+NAA 0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L培养基上的生根率为100.00%。综上所述,叶片纵切后能通过不定芽途径以及愈伤组织途径建立贵港报春苣苔的组织培养技术体系,在该体系下不定芽增殖系数高、愈伤分化高,组培苗生根好。     

6-BA对黑麦草愈伤组织诱导影响的初步研究

为了确立最佳的黑麦草再生体系,选用多年生黑麦草雅晴、沃土和一年生黑麦草特高等3个不同黑麦草品种的成熟种子为外植体,分别采用cc,Ms,NB,N6等4种基本培养基,在每种培养基中分别加入5mg／L的2,4-D和0,0．05,0．1,0．2和0．4mg／L等5种浓度的6-BA进行愈伤组织诱导。结果表明：在6-BA浓度为0．05mg／L时,黑麦草各品种愈伤组织的诱导率最高;在相同浓度6-BA作用下,不同黑麦草品种间愈伤组织诱导率存在显著的品种间差异;不同基本培养基对黑麦草愈伤组织的诱导率也存在影响,4种供试基本培养基中,以CC基本培养基的黑麦草愈伤组织诱导率最高。