猪呼吸道病原菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断由猪链球菌(SS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪支气管败血波氏杆菌(Bb)和猪肺炎支原体(Mhp)单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病的检测方法,基于上述6种病原菌对应的gdh(SS)、apxⅣA(App)、KMT1(Pm)、16S rRNA(Hps)、fla(Bb)和p36 ldh(Mhp)基因设计特异性引物,通过优化各反应条件建立了能同时检测SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的多重PCR方法。结果显示,该方法特异性强,仅对SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp有特异性扩增,对大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌等其他病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,对6种病原菌DNA的最低检出限分别为SS 8.66×10²拷贝/μL、App 1.05×10⁴拷贝/μL、Pm 8.61×10²拷贝/μL、Hps 9.01×10²拷贝/μL、Bb 7.54×10²拷贝/μL、Mhp 3.86×10...     

PRRSV感染猪体内多杀性巴氏杆菌的分离与血清型鉴定

应用常规方法和PCR技术,对来自安徽肥西、庐江、肥东、定远、桐城5个地区猪场检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性的肺脏进行多杀性巴氏杆菌(Pm)的分离及其血清型鉴定。结果显示,49份病料中分离鉴定出7株Pm,且均属于A型,分离率为14.3%,高于其他细菌(副猪嗜血杆菌、猪链球菌)的检出率。表明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)患猪继发或混合感染Pm的比率较高,而且A型Pm是安徽省感染猪群中的主要血清型。     

多重PCR方法快速检测猪的5种呼吸道病原菌

猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、副猪嗜血杆菌(Hps)、支气管败血波氏杆菌(Bb)、产毒性多杀巴氏杆菌(T+Pm)和猪肺炎支原体(Mhp)是最常见的几种猪呼吸道病原菌.笔者参照文献报道的基因序列设计针对App、Hps、Bb、T+Pm和Mhp的特异性引物,对单一PCR条件进行系统优化后建立5重PCR方法.该多重PCR方法能对同一样品中5种病原菌的DNA模板进行扩增,且在5种病原菌之间没有交叉反应;对大肠杆菌等其它6种常见猪细菌性病原的榆测结果均为阴性;对5种病原菌DNA模板检出的最小最均低于160 Pg,且能从攻毒小鼠(App、Hps、Bb和T+Pm)肺脏组织8 h增菌的培养物中快速检测出相应的病原菌.对中国华中地区269份临床样本的检测结果表明,5种呼吸道病原菌在华中地区猪群中普遍存在,且混合感染情况十分严重.这些试验结果表明该多重PCR方法可用于猪呼吸道病原菌App、Hps、Bb、T+Pm和Mhp的单一或混合感染的鉴别诊断及病原流行病学调查.     

副猪嗜血杆菌毒力菌株和猪支气管败血波氏杆菌毒力菌株双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能同时检测副猪嗜血杆菌(Hps)毒力菌株和猪支气管败血波氏杆菌(Bb)毒力菌株快速、准确的诊断方法,依据毒力血清型Hps OMP P2和Bb DNT基因序列分别设计合成引物,通过优化反应条件,成功建立了同时检测Hps毒力菌株和Bb毒力菌株的双重PCR方法。本试验建立的双重PCR法特异性强,重复性好,最低可检测核酸质量浓度分别达到1.79×10-3 g/L及8.3×10-3 g/L。使用该方法对来自四川地区部分猪场的36份猪呼吸综合征(PRDC)病料进行检测,结果检出率分别是33.33%和5.56%,与单一PCR结果一致,但高于细菌分离鉴定的准确率。试验结果表明该方法具有临床实用性,为四川地区Hps和Bb的诊断和预防奠定基础。     

辽宁地区猪场呼吸道病原菌的分离鉴定与耐药分析

为了了解辽宁地区规模化养殖场(户)中猪呼吸道病原菌的流行分布情况及耐药性情况。对2022—2023年采集规模化养殖场(户)中不同阶段的猪患呼吸道症状的咽拭子、鼻拭子、肺脏、肝脏及肾脏等病料组织349份，采用常规细菌分离鉴定方法对采集的349份猪患呼吸道症状的咽拭子、鼻拭子、肺脏、肝脏及肾脏等病料组织进行鉴定，采用K-B药敏纸片法分别测定分离呼吸道细菌性病原菌对临床中常用的药物耐药情况。结果显示：从349份病料样品中多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌支气管败血波氏杆菌菌株的检出率分别为7.8%(26株)、 12.2%(40株)、11.5%(39株)、21株(6.0%);分离的4种呼吸道病原菌均对头孢噻呋、头孢噻肟、氟苯尼考等7种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、新霉素等7种药物耐药。本研究为该地区规模化养殖场及散养户中不同阶段的猪呼吸道病防控及合理指导临床用药提供参考。     

猪呼吸道疾病综合征主要致病菌的分离鉴定

对3个猪场的4头呼吸道疾病综合征病猪肺脏(猪场分别编号A、B、C,其中猪场A 1头、猪场B 2头、猪场C 1头)进行猪肺炎支原体(Mhp)、副猪嗜血杆菌(Hps)和猪胸膜肺炎放线杆菌(App)PCR检测,进而进行细菌的分离鉴定和药敏试验。结果显示:4份病料中App和Mhp均为阴性,Hps在猪场A和C的病料中为阴性,猪场B病料中为阳性;在猪场A分离出奇异变形杆菌和猪链球菌各1株;猪场B分离出1株化脓隐秘杆菌、1株嗜麦芽窄食单胞菌和1株奇异变形杆菌;猪场C分离出1株化脓隐秘杆菌和1株奇异变形杆菌。药敏试验结果显示:化脓隐秘杆菌对诺氟沙星、洛美沙星敏感,嗜麦芽窄食单胞菌对恩诺沙星敏感,奇异变形杆菌对诺氟沙星、恩诺沙星敏感,猪链球菌对诺氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、氧氟沙星敏感。小鼠致病性试验结果表明:变形奇异杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和化脓隐秘杆菌均能使小鼠出现一过性精神萎靡;猪链球菌引起试验小鼠全部死亡,具有较强致病力。     

副猪嗜血杆菌血清型和外膜蛋白P5基因型多样性的研究

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)的血清型及基因型具有复杂多样性。本研究用间接血凝试验对某一猪场分离的Hps进行血清分型鉴定,并对部分菌株的外膜蛋白P5基因进行克隆测序和进化发育分析。试验结果显示,在21头病死猪不同部位共分离了42株Hps,其中 Hps血清5型17株(40.7%)、血清14型12株(28.5%)、血清4型1株(2.3%)和未定型12株(28.5%)。本试验中有5头猪同时感染2种不同血清型的Hps。21株Hps临床分离株分属5个不同基因序列型(STA～STE),其中STA有12株(12/21)为优势基因型;相同血清型的Hps分离株具有不同的STs型,来自同一头猪的Hps血清型和STs型也不相同。以上结果表明,同一猪群感染的Hps血清型和基因型存在明显的多样性,同一头猪感染Hps的血清型和基因型也存在多样性。本研究为进一步揭示猪群感染Hps的复杂性,研究该病的感染与流行机制提供了有价值的参考。     

一株副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

通过细菌分离,从安徽某规模化猪场分离到一株病原菌,通过分离纯化、生化鉴定和PCR鉴定,证实该分离菌为副猪嗜血杆菌,并通过间接血凝试验鉴定该株副猪嗜血杆菌的血清型为10型。     

新疆石河子垦区副猪嗜血杆菌的流行病学调查

通过对石河子垦区规模化猪场的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)进行流行病学调查,了解了当地规模化猪场副猪嗜血杆菌的流行现状。调查结果显示,330份血清样品的Hps抗体阳性率为60.30%,猪场感染阳性率为91.67%;经PCR检测,105份病料的阳性率为27.62%。     

闽北地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

从闽北地区16个规模化猪场分离到5株病原菌,经过分离纯化、形态学观察、细菌生化鉴定、PCR鉴定以及测序分析,分离菌株与已知的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)菌株16S rRNA序列同源性均在96%以上,确定5株病原菌均为副猪嗜血杆菌。通过致病性试验表明:分离菌株均有一定的致病性,其中Hps-jo株分离菌致死率达83.3%。细菌药敏试验表明:分离菌株对头孢噻呋、头孢氨苄、氟苯尼考敏感;对万古霉素、强力霉素、四环素、多黏菌素中度敏感;对环丙沙星、阿莫西林、恩诺沙星低、链霉素、TMP、新霉素耐药率达100%。试验结果为闽西地区副猪嗜血杆菌病的防治提供了参考。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其OmpP5基因序列分析

为研究辽宁省副猪嗜血杆菌(Hps)OmpP5基因的遗传变异规律,从辽宁省阜新市某猪场疑似患有副猪嗜血杆菌病的患猪肺部采取组织病料进行细菌分离,通过革兰染色、生化鉴定、卫星现象及Hps 16S rRNA PCR检测,鉴定为副猪嗜血杆菌。根据已发表的Hps OmpP5基因设计1对特异性引物,对分离株OmpP5基因进行扩增、克隆及测序,得到长度为1 116bp的OmpP5基因序列。将该序列与已发表Hps参考株的OmpP5基因进行同源性比对及系统发育树分析,发现核苷酸同源性为89.8%~99.5%,分离株与参考菌株№4在同一分支,表明OmpP5基因具有一定的保守性,分离株和№4亲缘关系较近。研究结果为阐明辽宁省Hps毒力基因及致病机理提供了参考依据。     

广东省副猪嗜血杆菌的流行病学调查

为了解副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)在广东省的流行情况,采用细菌分离鉴定和PCR方法对广东省79家规模化猪场的227头疑似关节炎、多发性浆膜炎的发病猪进行了检测。结果显示,副猪嗜血杆菌阳性率达22.74%。对猪场全年发病情况进行数据统计分析,发现1~3月Hps阳性率最高。使用间接血凝试验方法对55株临床分离株进行血清学分型,结果显示5型(23.68%)最为流行,其次是12型(13.16%)和4型(10.53%)。     

苏中地区猪源多杀性巴氏杆菌的分子流行病学调查

对来自苏中地区25个疑似感染多杀性巴氏杆菌的规模化猪场随机采取的250份病料进行了涂片镜检、分离纯化、生化试验、菌落荧光检测、菌体血清型鉴定、PCR鉴定和动物试验。结果分离出4个猪场共21株多杀性巴氏杆菌,21株多杀性巴氏杆菌中共检测出3个血清型,其中5型17株,1型3株和3型1株。通过对苏中地区猪多杀性巴氏杆菌流行情况的初步调查,为猪巴氏杆菌病的快速诊断和科学防治提供了重要依据。     

副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

在已建立的副猪嗜血杆菌(HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)的单重PCR检测方法的基础上,通过对扩增条件的优化,利用一次PCR反应可同时扩增出APP的256 bp、Pm的457 bp、HPS的822 bp的特异性片段,建立了HPS、Pm、APP的多重PCR实验室诊断方法。该复合PCR可检测60 pg的HPS、120 pg的Pm、50 pg的APP。利用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性猪体内分离到的39株细菌,结果显示HPS、Pm、APP分别为12、16、2株,对39份病料的检测与常规细菌分离鉴定结果一致,可见该方法适用于HPS、APP、Pm的临床快速检测。     

辽宁地区副猪嗜血杆菌血清型的鉴定

为探明辽宁地区副猪嗜血杆菌菌株的血清型,先后从辽宁省的锦州、营口、沈阳、丹东、铁岭、阜新、抚顺、朝阳、葫芦岛等市县采集以多发浆膜炎、关节炎、脑膜炎以及急性死亡为主要特征病猪的病料样本236份,从被检的236份病料中分离到86株副猪嗜血杆菌菌株,最终有51株鉴定出副猪嗜血杆菌血清型,分别为:血清1型2株;血清4型5株;血清5型21株;血清12型3株;血清13型20株。通过本研究初步确定了辽宁省副猪嗜血杆菌主要优势血清型,为辽宁省规模化猪场制定副猪嗜血杆菌病的防控措施提供依据。     

由我国传染性萎缩性鼻炎猪群猪鼻腔分离多杀巴氏杆菌的初步报告

1986～1988年,同步调查了13个 AR 猪场各种年龄不同品种猪(共2429头)的鼻腔 Bb 及 Pm 的感染情况.Bb总阳性率为33.4%,pm 总阳性率为2.9%,全部猪场均检出 Bb.7个猪场检出 Pm,其中6个场共检出65头 Pm 带菌猪,分离74株 Pm,包括 A 型7株,D 型67株,全部为非产毒素菌株(PmDNT~-)。检出和未检出 pmDNT~-的12个 AR 猪场,或有临床 AR 猪(28.8%),或解剖出 AR 猪(65.5%,87.5%),或有临床或解剖 AR 病史。这些猪场的 AR 病因显然与 Pm 无关,而与 Bb 育关.另一处有临床 AR 的猪场送检3头,有1头分到少量产毒素 D 型 Pm(PmDNT~ ).一假定健康猪场(非 AR 猪场)4年来均未检到 Bb,仅检到1株 D 型 PmDNT~-。     

四川南充地区部分猪场呼吸道疫病主要病原调查与分析

当前猪呼吸道疾病综合征是引发各类猪场经济损失的重要原因之一。该病病原种类繁多,危害巨大。本文通过PCR或病原菌分离鉴定,对四川省南充部分地区规模化猪场及散养户间猪呼吸道疾病综合征（PRDC）主要病原的混合感染状况进行了分析。对送检病料的猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪肺炎支原体（MH）、猪链球（SS）、产毒性巴氏杆菌（Pm）和副猪嗜血杆菌（HPS）等共计8种主要病毒性或细菌性病原进行检测。实验结果证明PRDC在四川省南充部分地区感染情况普遍存在,且致病病原种类繁多,感染类型复杂,所以在日常饲养中加强PRDC感染情况的监测,可有效地防控PRDC的发生。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及三价灭活疫苗免疫效力分析

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道早期定植菌也是格拉泽病的病原体,给猪场带来较严重的经济损失。为了调查副猪嗜血杆菌血清型的流行情况,采用细菌分离培养、玻板凝集法及PCR方法,从广东、广西、山东、江苏、江西45个规模化猪场送检的疑似样品中共分离鉴定了34株副猪嗜血杆菌,其中6株(17. 65%)血清4型、9株(26. 47%)血清5型、8株(23. 53%)血清12型、4株(11. 76%)血清13型以及7株(20. 59%)未定型菌株。为了有效地防控副猪嗜血杆菌病的流行,以4、5、12血清型优势流行血清型制备3价灭活苗,用仔猪免疫/攻毒试验评价3价灭活疫苗免疫保护力。动物实验表明,该疫苗对副猪嗜血杆菌4型、5型和12型具有较好的免疫保护能力。     

锦州地区副猪嗜血杆菌血清型鉴定

本研究先后从锦州市太和区、凌海、北镇、黑山、义县等地采集以多发性浆膜炎为主要特征的病猪病料13份,在被检的13份病料中分离到6株疑似副猪嗜血杆菌菌株,同时对所分离的菌株进行了形态学检查、分离培养、生化试验、PCR鉴定及血清型鉴定,最终证实6株为副猪嗜血杆菌,血清型分别为:血清4型1株、血清5型2株、血清12型1株、血清13型2株.本研究初步确定了锦州地区副猪嗜血杆菌流行菌株的血清型,为猪场制定副猪嗜血杆菌病的防控措施提供理论依据.     

猪巴氏杆菌病病原的分离与鉴定

辽宁锦州地区近几年猪巴氏杆菌病发生有上升趋势,给养猪业造成较大的损失。因此,有必要对猪巴氏杆菌病的病原菌进行较为系统的研究,为今后控制猪巴氏杆菌病提供依据。作者从锦州地区13个乡镇猪场的26个疑似病料中分离出6株多杀性巴氏杆菌,用琼脂扩散法进行菌体血清型鉴定,结果为5型4株,3型2株,现报告如下。