柔嫩艾美耳球虫serpin基因克隆与生物信息学分析

根据GenBank发表的Eimeria tenella serpin(Etserpin)基因设计1对引物,从孢子化卵囊总RNA中用RT-PCR方法扩增Etserpin基因,克隆后测序,应用生物信息学分析预测其核苷酸及其编码蛋白的结构与功能.结果表明,Etserpin开放阅读框为1 248 bp,编码一分泌蛋白,N端具有1个28 aa的信号肽,有1个跨膜区域,有2个糖基化位点和21个磷酸化位点,88,89,98～101,208～212,283～287,302～304区段是其可能的B细胞表位;同源性比对与进化树的分析表明其为抑制性serpin蛋白,结构保守,与F.acervulina、T.gondii和N.caninumm亲缘关系较近.二级结构以α螺旋和随机卷曲为主,具有类似于serpin家族蛋白的三级结构.     

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2基因的克隆与生物信息学分析

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2(Hapless2/generative cell-specific)基因的抗原性,根据GenBank发表的HAP2基因的cDNA序列ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,同时应用生物信息学软件对HAP2基因表达蛋白的结构域和在柔嫩艾美耳球虫生活史的各阶段表达情况进行预测。结果获得867 bp的目的基因扩增片段,经同源性分析比较柔嫩艾美耳球虫HAP2基因与其他艾美耳球虫种HAP2基因同源性在70%以上,该基因所表达的蛋白主要在球虫配子生殖阶段的配子体和未孢子化的卵囊中表达。说明HAP2基因具有作为传播阻断疫苗的候选抗原的可行性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

柔嫩艾美耳球虫研究概况

本文简要介绍柔嫩艾美耳球虫生活史、生物学特性、卵囊形状、以及卵囊产量的影响因素，对柔嫩艾美耳球虫日龄与粪便卵囊产量进行科学的分析，旨在为疾病的治疗和预防提供依据。     

柔嫩艾美耳球虫病毒的鉴定

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。感染鸡的艾美耳属球虫中,国外已报道在巨型艾美耳球虫（E.maxima）,堆型艾美耳球虫（E.acervu-lina）,毒害艾美耳球虫（E.necatrix）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）中发现了病毒粒子或病毒RNA。但是作为危害最严重的柔嫩艾美耳球虫是否有病毒感染,国内外迄今尚无报道。本研究首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并对其进行了鉴定。通过核酸分析、RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和电镜形态观察对病毒进行鉴定。核酸酶的敏感性试验结果表明在柔嫩艾美耳球虫总核酸电泳图谱上观察到的大小分别为1.4、2.4和3.6kb的3条病毒带均不能被DNA酶（100mg/L）降解,但可被RNA酶（1.0mg/L）降解,表明这些核酸为RNA。另外,这些核酸不能被高盐浓度（0.3mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,但可被低盐浓度（0.015mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,并且采用α-32P标记的UTP掺入法测得该病毒样核酸具有RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）活性,表明这些核酸为双链RNA（dsRNA）。利用蔗糖梯度离心和透射电镜技术对柔嫩艾美耳球虫病毒进行了分离和鉴定。电镜负染观察到柔嫩艾美耳球虫病毒粒子外观呈球形,二十面体,无囊膜,直径38nm。     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

柔嫩艾美耳球虫电穿孔转染条件的优化

低转染效率一直是利用基因转染技术研究柔嫩艾美耳球虫的主要屏障。为了进一步提高现有的转染效率,本研究分别利用传统的Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪和新型的NucleofectorⅠ核转仪对柔嫩艾美耳球虫子孢子的转染条件进行了优化。通过对外源DNA浓度、电场强度、环境温度及NucleofectorⅠ核转仪的内置程序这些关键参数的探索,最终发现利用Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪设置电压为2000 V,电容25 μF,利用4 mm电击杯进行电转时,转染效率最高,达到3.8×10-4,此时最佳质粒浓度为50 μg/107子孢子。     

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测.结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效.然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组.综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的.     

2株柔嫩艾美耳球虫对5种抗球虫药的抗药性

选择130只21日龄雏鸡，研究了柔嫩艾美耳球虫（E.tenella)南京株和凤阳株对地克珠利（Diclazuril)、马杜霉毒（Maduramicin)、氯羟吡啶（Clopidol)、氯苯胍（Robenidine)和氨丙啉（Amprolium)的抗药性。试验鸡随机分成13组，其中每株球虫均设5个感染用药组，1个感染不用药组，另设1个不感染不用药组，每组10只鸡。以POAA，RLS，ROP，ACI作为指标。结果表明，2株柔嫩艾美耳球虫均对氨丙啉轻度抗药，对地克珠利敏感或轻度抗药，对氯羟吡啶中度抗药。对马杜霉和氯苯胍中度抗药或安全抗药。提示：目前在凤阳地区可合理地使用地克珠利和氨丙啉，对氯羟哟啶应慎用，对马杜霉素和氯苯胍须减少或暂停使用。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

柔嫩艾美耳球虫YL株抗药性研究

用柔嫩艾美耳球虫杨凌株 ( YL t)对 1 4日龄雏鸡进行感染 ,检测了该虫株对 4种常用抗球虫药 (马杜拉霉素、地克珠利、克球粉和氯苯胍 )的敏感性。以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标 ,进行综合评定 ,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性 4个等级。结果表明 ,该虫株对马杜拉霉素有轻度抗药性 ,对地克株利有完全抗药性 ,对克球粉和氯苯胍无抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫BJ株EtlA基因的克隆及序列分析

本文参照已发表的柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)折光体蛋白基因序列，根据其阅读框及载体序列特点，两端分别加上EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点设计引物，以E．tenella BJ株的总RNA为模板，进行RT—PCR扩增，成功扩增出EtlA基因。将PCR产物与pGEM—T载体连接后，转化JM109感受态细胞，蓝白斑法筛选阳性克隆并测序。测序表明，该基因全长1978bp，其阅读框大小为1944bp；与Gen Bank登记的EtlA基因相比较，有6个部位、共7个碱基发生了突变，其中5个有意义突变，2个无意义突变，同源性达99．5％。与堆型艾美耳球虫(E．acervulina)的EalA基因的同源性为79．3％，而与牛艾美耳球虫(E．bovis)的同源性只有19．5％。表达产物具有核苷酸转氢酶的功能，推测可为子孢子侵入宿主细胞提供能量。     

巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感试验

为检测巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对常用抗球虫药的敏感性,选用地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、盐霉素和拉沙洛西等8种抗球虫药进行鸡体试验,通过抗球虫活性百分比（percent of optimum anticoccidial aetivity,POAA）、病变记分减少率（reduction of lesion scores,RLS）、相对卵囊产量（relative oocyst production,ROP）和抗球虫指数（anticoccidial index,ACI）4项指标进行综合评价。结果表明,巨型艾美耳球虫早熟株对8种药物敏感;柔嫩艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感,对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西敏感。本研究结果可为对球虫早熟株疫苗的开发与应用提供实验依据。     

五种不同来源柔嫩艾美耳球虫耐药性虫株的检测

五种不同来源柔嫩艾美耳球虫耐药性虫株的检测秦建华，赵月兰，田勇，张明勇（张家口农业高等专科学校０７５１３１）国外，近年来对鸡球虫的耐药性进行了大量研究，为合理选择和正确使用抗球虫药以防治球虫病奠定了良好的基础。我国在这方面研究较少，实际用药过程中十分...     

柔嫩艾美耳球虫洛阳分离株的致病性研究

利用人工感染试验,研究柔嫩艾美耳球虫洛阳分离株的致病性。结果表明,随着感染剂量的提高,其死亡率上升,平均增重下降、平均病变记分提高,半数致死量(LD50)为3.248 7×104个/只。为洛阳地区防控其柔嫩艾美耳球虫所病提供了依据。     

鸡胚接种柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫活卵囊的免疫保护试验

给18日龄鸡胚接种一定剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella)和/或堆形艾美耳球虫(E.acervulina)孢子化卵囊,出雏后在无球虫环境中笼养,1~10日龄每天收集各组粪便样本,计数克粪便卵囊数(OPG),并于14日龄时以大剂量同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、饲料转化率(FCR)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果显示,以E.tenella或E.acervulina卵囊免疫18日龄鸡胚,其卵囊排出的潜隐期及达到峰值的时间与1日龄雏鸡接种组相一致,有相似的排卵囊曲线,提示其诱导免疫的建立是在出雏后开始建立的。攻虫后各免疫组的RWG由攻虫对照组的31.9%~51.7%提高到了76.5%~83.6%,RCR由攻虫对照组的4.11~4.89改善为2.72~2.96,ROP降至4.7%~23.5%。结果表明以一定剂量E.tenella和E.acervulina卵囊单独或混合经羊膜腔免疫18日龄鸡胚都可以建立起针对出雏后14日龄同源攻虫的良好免疫保护力。比较混合免疫E.tenella和E.acervulina卵囊组与单一接种E.tenella或E.acervulina卵囊组的免疫效果发现,混合免疫组的各项指标均稍优于后者。     

柔嫩艾美耳球虫感染鸡的体液免疫机理研究

为了揭示鸡柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）病的免疫机制，试验从分子水平、细胞、亚细胞对人工攻毒病鸡特异性抗体、免疫细胞的动态变化及在抗球虫中的作用进行了探讨，试验结果如下：一是雏鸡感染E．tenella后，第6天即可在外周血液中检测出特异性IgG，于第18天达到峰值，第23天开始下降，第30天时降至感染后第7天的水平；二是揭示了雏鸡感染E．tenella后，鸡体IgG生成细胞的动态变化规律为：主要免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体和盲肠局部的IgG生成细胞于第2天和第3天开始增殖，在第9天至第16天达到峰值，然后逐渐下降，盲肠扁桃体中的IgG生成细胞在第18天降至对照组水平，盲肠、脾脏和法氏囊中的IgG生成细胞数在第22天仍高于对照组，且差异显著。     

雏鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫病理组织学动态变化研究

目的采用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊人工感染雏鸡,在不同时间内观察临床症状及病理学变化。方法10日龄伊莎褐雏鸡分别口服艾美耳球虫孢子化卵囊5×104/只,每天观察临床症状、粪便及病死状况,并在接种后3、5、7、9、11、13、17、19、21 d各捕杀3只,进行剖检,观察各组织器官病理变化。结果被感染雏鸡4 d后出现食欲减退,精神萎顿;5~13 d可视黏膜、冠、垂髯苍白,消瘦、腹泻,血便排出,严重者粪便如水样带血或为全血,继而死亡。剖检,盲肠明显肿胀,出血严重,肠腔内有较坚硬的干酪样肠芯。病理组织学以出血、坏死性肠炎为特征,并在肠及肠腺上皮细胞内见有数量不等的裂殖体,盲肠扁挑体淋巴滤泡明显增大,淋巴细胞增生;15 d后受损肠粘膜渐渐修复,21 d盲肠基本恢复正常。结论雏鸡感染孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊后,盲肠损伤最为严重,具有典型病变。