金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路和相关修复因子的影响

采用金黄色葡萄球菌侵袭原代奶牛乳腺上皮细胞,观察该病原菌对乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白和相关修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达的影响。金黄色葡萄球菌以MOI=1∶1的比例接种奶牛乳腺上皮细胞,分别作用0,15,30,45,60,120,240 min,采用Western blot法检测乳腺上皮细胞β-catenin、Cyclin D1及c-Myc蛋白表达水平;免疫荧光法检测β-catenin的表达及核易位;荧光定量PCR检测EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达。结果显示,β-catenin蛋白在45,60,120 min表达量升高,与0 min相比差异显著(P<0.05);Cyclin D1蛋白在45,60,120和240 min表达量升高,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01);c-Myc蛋白在15,30,60,120,240 min表达量升高,差异极显著(P<0.01)。修复相关因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA的表达量在30 min均出现极显著升高(P<0.01),且VEGF基因mRNA在45,60,120和240 min均呈现极显著升高(P<0.01),EGFR基因mRNA表达量在30,45和60 min时表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,金黄色葡萄球菌侵袭奶牛乳腺上皮细胞后,诱导Wnt/β-catenin信号通路的转导和修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因转录,该信号通路和修复因子可能参与金黄色葡萄球菌导致的炎症和细胞损伤的修复过程。     

猪肾细胞(PK15细胞)ABCA1基因与miRNA-758关系的研究

为了研究猪肾细胞(PK15细胞)中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ABCA1)mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用Real-time qPCR技术检测转染24 h后细胞内ABCA1 mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系。结果表明:在PK15细胞中转染miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照后,ABCA1 mRNA表达量均极显著升高(P0.01)。转染miR-758模拟物的PK15细胞miRNA-758表达量高于对照组30 000多倍,差异极显著(P0.01);而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著(P0.05)。说明miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1 mRNA表达量升高;miR-758模拟物可促进PK15细胞miR-758表达量上升30 000多倍,而对ABCA1 mRNA表达量并未表现出抑制作用,PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758模拟物影响或受影响小;miR-758抑制物确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1 mRNA表达量升高。     

苜蓿源miR168b通过靶向肉碱棕榈酰转移酶1A对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和脂滴积累的调控研究北大核心CSCD

本试验旨在探究苜蓿源miRNAs(mtr-miRNAs)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖和凋亡的影响。试验首先通过CCK8、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、流式细胞术、基因和蛋白定量等方法检测苜蓿源-miR168b(mtr-miR168b)对BMECs增殖、凋亡和周期的影响。然后,敲低mtr-miR168b靶基因肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)表达后,检测了BMECs的活力和凋亡。通过诱导转染后细胞,用氟硼二吡咯(Bodipy)染色和油红O染色检测mtr-miR168b和CPT1A基因干扰对BMECs脂滴合成的影响。结果表明:1)mtr-miR168b高表达极显著降低了BMECs活力(P<0.01)。2)mtr-miR168b高表达极显著抑制了BMECs增殖(P<0.01),延长了细胞G1~S期进程,极显著促进了细胞凋亡(P<0.01)。3)mtr-miR168b在BMECs中高表达极显著抑制了细胞增殖基因周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白D2(Cyclin D2)的基因的表达水平(P<0.01),极显著增加了凋亡标志基因Bcl2关联X蛋白(BAX)基因的表达水平(P<0.01),极显著抑制了PCNA蛋白表达水平(P<0.01),极显著增加了BAX蛋白表达水平(P<0.01),并且mtr-miR168b显著抑制了蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的表达水平(P<0.05)。4)mtr-miR168b高表达抑制了BMECs中脂滴的积累。5)干扰mtr-miR168b的靶基因CPT1A,对BMECs脂滴积累也有抑制作用。综上所述,mtr-miR168b可通过抑制BMECs增殖,促进细胞凋亡,并通过靶向CPT1A基因抑制BMECs中脂滴的生成。试验结果可为mtr-miRNAs调控牛奶乳脂合成提供分子层面的技术支撑。     

他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

【目的】研究他莫昔芬(Tamoxifen)在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)感染的抗病毒作用。【方法】以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】他莫昔芬用药浓度在6μmol/L时对细胞活力无影响;在6μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响(P>0.05)。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组(P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细...     

Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

【目的】 探究敲除Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）基因对水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）复制的影响。【方法】 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞（porcine renal epithelial cells，PK15）系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞，收获慢病毒并感染PK15细胞，经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^-/-多克隆细胞，并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功，分别利用光学显微镜和细胞毒性检测（cell counting kit 8，CCK-8）观察并检测PK15、PK15-TLR7^-/-细胞的形态与活力；利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后病毒增殖情况；利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况；利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后子代病毒产生情况。【结果】 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑，其中sgRNA2的基因编辑效率最高，但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力；当感染VSV-GFP后，通过荧光显微镜观察发现，荧光强度随着时间逐次增加，且PK15-TLR7^-/-细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示，相同时间点的PK15-TLR7^-/-细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞（P<0.05；P<0.01）；实时荧光定量PCR结果表明，感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加，且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）；Western blotting结果表明，PK15与PK15-TLR7^-/-细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达，表达量随时间逐渐增多，且在PK15-TLR7^-/-细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高；感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放，此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7^-/-细胞（P>0.05），但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）。【结论】 TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制，初步验证了TLR7在天然免疫中的作用，为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

感染伪狂犬病病毒对小鼠脑细胞周期及相关因子的影响

为了研究感染猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)对小鼠脑细胞周期及相关因子的影响,试验将40只6周龄Balb/c小鼠随机分成对照组和36小时组、48小时组、60小时组,试验组经皮下接种含量为1×10³ TCID₅₀/100μL的PRV溶液200μL,对照组注射等量生理盐水。试验采用流式细胞术检测脑细胞周期变化,并采用实时荧光定量PCR和Western-blot方法分别检测细胞周期相关因子基因和蛋白质的表达情况。结果表明：与对照组相比,感染PRV后36小时,处于G0/G1期的细胞比例极显著升高,而处于S期的细胞比例则极显著降低(P<0.01)。感染PRV后36小时,CDK4和CDK6基因相对表达量显著和极显著下降(P<0.05,P<0.01),60小时时恢复到对照组水平(P>0.05);感染PRV后36,48小时,cyclin D基因相对表达量极显著降低(P<0.01);而在感染PRV后36小时时cyclin E基因相对表达量显著上升(P<0.05),60小时时极显著上升(P<...     

干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

【目的】 探究对牛骨骼肌发育具有调控作用的长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）,研究其在牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期的表达量变化,为牛肌肉发育相关机制方面的研究提供参考依据。【方法】 选取实验室前期高通量测序获得的1条lncRNA （lnc721）,通过NCBI数据库和CPC网站分析其生物学信息并预测其编码能力,通过核质分离试验确定其亚细胞定位。设计并合成lnc721的siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞,通过成熟的体外成肌细胞诱导分化模型培养牛骨骼肌卫星细胞并进行诱导分化。分别采用EdU试验、实时荧光定量PCR和Western blotting分析lnc721在细胞发育不同时期表达量的变化情况。【结果】 lnc721位于牛全基因组的18号染色体上,其蛋白编码能力为―1.33129,主要定位于细胞质内。在干扰lnc721表达量后发现,EdU阳性细胞比率极显著上升,细胞增殖标志因子Pax7和Ki-67基因的mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）;Western blotting结果进一步证明,干扰lnc721后极显著促进了Pax7蛋白的表达（P<0.01）,在细胞分化期干扰lnc721表达后,细胞分化标志因子MyHC基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著下调（P<0.01）。【结论】 干扰lnc721表达可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制成肌分化进程。     

黄芪多糖对玉米赤霉烯酮诱导鸡胸腺细胞凋亡的保护作用

为了探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)对玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)诱导的鸡胸腺细胞凋亡的影响,试验以鸡原代胸腺细胞为材料,采用MTT法检测APS对鸡胸腺细胞的安全浓度;选取50,100,200,400μg/mL APS分别与ZEA同时处理胸腺细胞48 h,并设置细胞对照和ZEA模型对照,MTT法检测细胞存活率;应用实时荧光定量PCR法检测内质网应激和细胞凋亡相关基因mRNA的表达。结果表明：APS对鸡胸腺细胞的安全浓度为50～400μg/mL;与细胞对照比较,ZEA模型对照能极显著降低细胞存活率(P<0.01),且GRP78、ATF6、ATF4、Caspase-3、Bax基因mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),Bcl-2基因mRNA相对表达量极显著下降(P<0.01);与ZEA模型对照比较,不同浓度APS+ZEA能显著或极显著提高细胞存活率(P<0.05或P<0.01),且GRP78、ATF6、ATF4、Caspase-3、Bax基因mRNA相对表达量极显著下降(P<0.01...     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素（MSTN）与基质金属蛋白酶（MMPs）的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系：单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调（P < 0.01）;细胞外基质中纤连蛋白（FN）和层连接蛋白（LN）含量均极显著增加（P < 0.01）。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞（P < 0.01）;Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响

为研究不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响，本试验利用三联诱导法将3T3-L1细胞经诱导分化为3T3-L1脂肪细胞。当3T3-L1脂肪细胞密集后分别采用0（对照组）、0.2、0.5、1.0 μmol/L生物素处理，分别在12、24与48 h时检测细胞上清液中甘油释放量、脂肪甘油三酯水解酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）、脂滴包被蛋白A （perilipin A）及脂肪分化相关蛋白（ADRP）相对表达量。结果显示，在12 h时，1.0 μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组（P<0.01），0.5、1.0 μmol/L组HSL基因mRNA相对表达量显著低于对照组（P<0.05），1.0 μmol/L组perilipin A、ADRP基因mRNA相对表达量均极显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.01）；在24 h时，各试验组甘油释放量、1.0 μmol/L组ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组（P<0.01），0.5、1.0 μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量极显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.01）；1.0 μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于其他组（P<0.01）；在48 h时，1.0 μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著或显著低于对照组（P<0.01；P<0.05），1.0 μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.05），0.5、1.0 μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于对照组（P<0.01）。综上所述，生物素可通过促进perilipin A与ADRP表达，同时抑制ATGL与HSL表达，达到抑制脂肪分解的效果，且浓度为1.0 μmol/L时效果最佳。     

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P<0.01);细胞增殖受到显著抑制(P<0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P<0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P<0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P<0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P<0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响

实验旨在研究TCF21基因在鸡前脂肪细胞增殖过程中的功能。以鸡永生化前脂肪细胞系(ICP1)和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞为实验材料,首先利用qRT-PCR实验方法分析TCF21在ICP1细胞和鸡原代前脂肪细胞增殖过程中的表达规律,其次利用CCK-8比色法研究过表达和干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖过程中细胞数的影响,最后利用qRT-PCR实验方法分析细胞增殖过程中标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的表达情况。结果表明:TCF21基因在ICP1细胞和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞的增殖过程中均呈下降趋势;过表达TCF21基因抑制鸡前脂肪细胞的增殖,且细胞增殖标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的mRNA表达水平下调;干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖无明显影响。综上所述,TCF21可能对鸡前脂肪细胞的增殖有一定的抑制作用。     

肿瘤坏死因子-α对小鼠小肠类器官生长、屏障功能和肠道功能细胞的影响

【目的】研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对小肠类器官生长、紧密连接蛋白及各种功能细胞标记基因的影响,以建立小肠类器官的疾病损伤模型。【方法】取小鼠小肠,用温和细胞解离试剂(GCDR)消化液分离小鼠隐窝细胞并用肠道类器官培养基培养。选取0(对照组)、50、250、500 ng/mL TNF-α刺激小肠类器官48 h,光学显微镜下观察类器官生长情况,Edu染色示踪细胞增殖的情况,利用实时荧光定量PCR检测细胞增殖、屏障功能和肠道功能细胞标记基因mRNA表达水平。【结果】(1)与对照组相比,50和250 ng/mL TNF-α显著降低小肠类器官的出芽率(P<0.05),而对类器官形成率无影响(P>0.05);250和500 ng/mL TNF-α导致小肠类器官坏死率显著升高(P<0.05)。(2)与对照组相比,250 ng/mL TNF-α显著降低小肠类器官紧密连接蛋白Occludin mRNA表达量(P<0.05);500 ng/mL TNF-α显著提高小肠类器官紧密连接蛋白Claudin-1 mRNA表达量(P<0.05)。(3)与对照组相比,50、250...     

牛坏死杆菌对EPH4细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用

为探究牛坏死杆菌对小鼠乳腺上皮细胞系(EPH4细胞)增殖和凋亡的影响,本研究将坏死杆菌(牛A25菌株)以感染复数(MOI)为100感染EPH4细胞,用EdU细胞增殖法检测细胞增殖率,用Hoechst染色以及DNA Ladder检测细胞凋亡,并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测凋亡基因的mRNA相对表达量变化。EdU检测结果显示,坏死杆菌可抑制EPH4细胞增殖;Hoechst染色以及DNA Ladder检测结果均显示,坏死杆菌可促进细胞凋亡的发生;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,坏死杆菌感染EPH4细胞2 h时,促凋亡基因Bax、Bax/Bcl-2的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),感染4 h时,促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.001),感染6 h时,促凋亡基因AIF的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.001)。由此可见,牛坏死杆菌能够抑制EPH4细胞增殖且诱导细胞凋亡,为进一步研究坏死杆菌致病机制提供了相关数据支持。     

腹腔注射GnIH对瑶鸡卵巢糖代谢的影响

旨在探究促性腺激素抑制激素(GnIH)对瑶鸡卵巢糖代谢的影响。将10只瑶鸡随机分为对照组(0.9%生理盐水)和GnIH组(24.54μg/kg GnIH),每组5只。每天7:00和19:00注射生理盐水或GnIH(100μL/次),连续注射14 d,观察并记录瑶鸡的采食情况；采用实时荧光定量PCR方法对瑶鸡卵巢中糖代谢相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、乳酸脱氢酶B(LDHB)和琥珀酸脱氢酶B(SDHB)mRNA表达量进行检测；采用试剂盒对卵巢中葡萄糖、丙酮酸含量进行检测。结果：与对照组相比，GnIH组注射后1、2、4、8 h,瑶鸡的采食量显著升高(P<0.05),夜间平均采食量极显著升高(P<0.01),卵体比显著下降(P<0.05);GLUT1、GLUT3 mRNA的表达量极显著上升(P<0.01),PK、PFK和LDHA mRNA的表达量显著上升(P<0.05),LDHB和SDHB mRNA的表达量显著下降(P<0.05);丙酮酸含量显著升...     

亮氨酸对猪胎盘滋养层细胞增殖及氨基酸转运的影响

为研究亮氨酸(Leu)对猪胎盘滋养层细胞(pTr)增殖、凋亡以及氨基酸转运载体表达的影响及其机制,本试验用不同浓度Leu(0、1、10 mmol/L)分别处理pTr细胞24 h和48 h后,使用荧光定量PCR技术检测pTr细胞增殖和凋亡相关基因、氨基酸转运载体以及mTOR信号通路关键蛋白等的mRNA表达水平。结果表明:Leu处理pTr细胞24 h后,1 mmol/L试验组的SNAT1(P<0.01)、4E-BP1 (P<0.05)和eIF4G(P<0.05)的mRNA相对表达量低于对照组;Leu处理pTr细胞48 h后,1 mmol/L试验组LAT1(P<0.05)、4E-BP1(P<0.01)的mRNA相对表达量低于对照组,10 mmol/L试验组CDK4(P<0.05)、4E-BP1 (P <0.01)、SNAT1 (P <0.01)、SNAT2 (P <0.01)、LAT1 (P <0.01)以及rBAT (P <0.05)的mRNA相对表达量也低于对照组;Leu处理pTr细胞24 h和48 h后,10 mmol/L组mTORC1的mRNA相对表达量较对照组和1 mmol/L组均极显著提高(P<0.01)。可见,10 mmol/L Leu会抑制pTr细胞的增殖活力,并可能通过mTOR信号通路的介导,降低了pTr细胞氨基酸转运载体的表达。     

As2O3对大鼠BRL-3A和RH-35细胞TRβ1和Cyclin D1因子的影响

为了探明As₂O₃对大鼠肝脏细胞系BRL-3A和肝癌细胞系RH-35中TH信号通路的关键调控因子TRβ1和TRβ1的下游因子Cyclin D1的影响，采用qRT-PCR、Western blot技术检测2种细胞中TRβ1和Cyclin D1的基因和蛋白表达变化。结果显示：(1)与对照组相比，As₂O₃作用BRL-3A细胞12 h, 1.563μmol/L组TRβ1蛋白表达显著降低(P<0.01)、Cyclin D1表达显著升高(P<0.01);6.250μmol/L组TRβ1表达明显降低(P<0.05)、Cyclin D1表达显著降低(P<0.01)。As₂O₃作用24 h, 1.563μmol/L组TRβ1蛋白表达明显升高(P<0.05);6.250μmol/L组TRβ1显著升高(P<0.01),Cyclin D1的表达显著降低(P<0.01)。As₂O₃作用48 h,...     

lncRNA在乙脑病毒感染PK15细胞过程中的作用研究

本研究旨在初步探索乙脑病毒（JEV）感染PK15细胞后的增殖情况,筛选与病毒感染相关的lncRNA,并对其进行亚细胞定位及靶基因预测。通过免疫荧光试验来检测病毒结构蛋白E的表达情况,采用TCID₅₀法检测PK15细胞中病毒的增殖情况,利用实时荧光定量PCR检测病毒感染后lncRNA的表达水平,在NONCODE数据库对lncRNA进行亚细胞定位,通过starBase、NONCODE、KEGG等数据库对其进行靶基因预测和信号通路分析。结果显示,JEV感染PK15细胞后,24~36 h为病毒滴度指数增长期,感染后36 h病毒滴度已达10^-5.75 TCID₅₀/mL。PK15细胞在感染JEV 12 h后,lncRNA A、B、C表达水平均无显著变化（P>0.05）,lncRNA D表达水平极显著下降（P<0.01）;感染JEV 24、36和48 h后lncRNA A、B、C表达水平极显著上升（P<0.01）,lncRNA D表达水平极显著下降（P<0.01）。lncRNA A主要定位在胞质溶胶,lncRNA B在细胞核和细胞质中均有分布,lncRNA C主要定位在细胞质中,在细胞核中也有可能分布,lncRNA D可能在细胞内呈现广泛性分布。通过靶基因预测和信号通路分析,lncRNA A、B、C的靶基因主要为OAS1、OAS2、OASL、COX1等,lncRNA D的靶基因主要为DST、ND1、ND2、ND4等。信号通路分析发现lncRNA可能通过肿瘤坏死因子（TNF）、NF-κB和Toll样受体（TLR）等信号通路参与病毒感染后的增殖过程。本研究为进一步探索宿主细胞lncRNA对病毒增殖的影响奠定一定的基础。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。