食品级乳酸菌表达系统的研究进展

乳酸菌以其安全、操作简单等优点被广泛用于表达外源基因,在食品、农业及医药工程领域,具有广阔的应用前景,开发了一系列乳酸菌食品级基因表达系统。目前已建立了糖诱导表达系统、噬菌体φ31暴发式诱导表达系统、乳链球菌素调控表达系统、温控表达系统等。随着基因工程技术的发展, 以重组乳酸菌作为基因工程菌的时代将要到来。     

"食品级"乳酸菌表达载体系统的研究进展

目前,多数外源基因的克隆与表达,主要采用大肠杆菌.然而,由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻,导致机体损伤,所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准.     

人工饲料组成对BmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的影响

为进一步提高家蚕杆状病毒—家蚕 (BmNPV Bm)表达系统的表达活性 ,通过改变人工饲料中桑叶粉、大豆粉、玉米粉和水分的添加量 ,探讨了人工饲料的营养组成对BmNPV Bm表达系统外源植酸酶基因表达活性的影响。在大豆粉含量相同的条件下 ,植酸酶基因表达活性随桑叶粉含量的增加而降低 ,桑叶粉含量为 10 %时表达量最高 ;在桑叶粉含量相同的情况下 ,大豆粉含量为 35 %时表达量最高 ;饲料含水量以添加干物重的 1 9倍时表达量最高。外源基因的表达活性与蚕体重的生长表现出一致的趋势。     

山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统

为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达，利用山羊β-酪蛋白5’端1．132kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因polyA(BGHPA)序列、基质结合区(matrixattac}linentregion，MAR)和多克隆住点(MCS)，构建了乳腺组织定位通用表达裁体pMRPA，鉴定正确后，将2．1kb的人组织型纤溶酶原激活荆(tissue—type plasminogen activator，tPA)cDNA克隆到pMRPA多克隆位点，获得重组表达载体pMRPA—tPA。在不同的泌乳时间，使用不同的包裹剂，采用不同的剂量，将pMRPA—tPA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示，所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现，泌乳稳定期表达效果最好，tPA表达水平在2．020～6．959mg／L；表达量随DNA用量的增加而提高；使用普通包裹剂和裸质粒相比，普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究，为通过乳腺暂时表达系统改良乳汁蛋白组成提供了重要依据。     

乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展

乳酸菌以其遗传工程可行并操作简单,在建立和研究乳酸菌食品级高效表达载体系统方面具有十分重要的实际意义。本文对乳酸菌食品级高效表达载体系统的最近研究及其在外源基因表达方面的应用概况进行初步总结。指出食品级乳酸菌工程及其表达产物可直接用于食品工业、医药和保健品等领域,是具有巨大应用前景的技术。     

毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策

本文简述了毕赤氏酵母作为外源蛋白表达系统所具有的优越性,以及常规的试验流程,论述了该系统在表达外源蛋白时存在的缺陷并针对这些缺陷提出了相应的对策。     

毕赤酵母在基因克隆与表达中的应用

随着分子生物学及基因工程的发展,利用自身基因在外源细胞中的克隆与表达也受世人关注。生物表达系统的出现满足了科学发展的要求,并渐渐成为处理工农生产以及医疗卫生等领域问题的重要手段之一[1]。近年来,蛋白表达系统已有原核表达系统、真核表达系统、哺乳动物表达系统和昆虫细胞表达系统等。不同的表达系统,其有不同的特点。如原核表达系统主要是大肠杆菌,其表达体系相对简单,目的蛋白无法经     

巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展

第一个被选择用于表达外源蛋白的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),人们对其基因操作和生物学特性比较了解,长期用于发酵的经验也显示其安全可靠.然而实践证明,酿酒酵母表达系统也有其局限性,如缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易于丢失等,也不是理想的外源基因表达宿主.     

犬2型腺病毒E3区缺失性表达载体的构建及外源基因表达

为构建可用于同源重组或体外重组的犬腺病毒（canime adenovirus,CAV)E3区缺失性表达载体，在克隆的E3区两末端设计并合成了2对突变引物，在引物中分别引入1个BgⅠⅡ酶切位点，以PBE3质粒为模板，经2次点突变后，得到含有2个BgⅠⅡ位点的重组质粒PBE3^M。该质粒经BgⅠⅡ酶切后自连得到E3缺失的质粒PBE3△。在PBE3△质粒的BgⅠⅡ位点加入接头后，产生含多个酶切位点的质粒PBE3L，经相应的酶切鉴定，证明突变，缺失和接头连接正确后，利用PBE3L分别构建了带有和不带有外源性启动子的绿色荧光蛋白基因的重组表达质粒，并分别进行转染以检测其表达。结果显示，PBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后，于36h即可观察到荧光，72-96h无明显差别，传3代后仍可见表达荧光的细胞；而PBE3LGFP质粒转染DK细胞后经检测无表达。结果表明，构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的的基因的表达，外源性启动子的加入是必要的。     

大肠杆菌表达系统的影响因素

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但并非每一种基因都能在其中有效表达。基因的表达受到多种因素的影响,表达效率也有很大差异。本文从外源基因本身特性和表达系统的特性及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras），作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。     

瘤胃投喂外源乳酸菌对奶牛胃肠道活菌比例及挥发性脂肪酸浓度的影响

试验旨在研究外源乳酸菌对奶牛胃肠道活菌比例及挥发性脂肪酸(VFA)浓度的影响。选取4头安装永久性瘤胃和十二指肠瘘管的荷斯坦成年干奶牛,试验共分3期,每期正试期7 d,间隔期20 d。采用自身对照试验设计,第1期为空白对照组,第2、3期(试验组)分别在晨饲后1 h(10:00)打开瘤胃瘘管塞投喂植物乳杆菌和乳酸菌复合系的菌粉。每期试验最后3 d连续采集瘤胃液、十二指肠内容物以及直肠粪样,检测样品中活细菌占总细菌的比例以及VFA浓度。结果表明:在瘤胃中,添加外源乳酸菌复合系可以提高活菌比例,但降低了VFA浓度(P<0.05);在十二指肠中,乳酸菌复合系组活菌比例高于植物乳杆菌组(P<0.05),但与对照组差异不显著(P>0.05),乳酸菌复合系组的乙酸和总挥发酸(TVFA)浓度高于对照组和植物乳杆菌组(P<0.05);在直肠中,不同处理组间VFA浓度差异不显著(P<0.05)。上述结果表明,添加外源植物乳杆菌和乳酸菌复合系虽然可以提高瘤胃中活菌比例,但降低了瘤胃VFA浓度,对肠道后段活菌比例及VFA浓度的影响有限。     

爪蟾用于启动子组织特异性表达检测的初步研究

本实验利用绿色荧光蛋白（GFP）与嗜上皮启动子EDL2连接，运用显微注射技术将EDL2－GFP注射入爪蟾受精卵以制备转基因蛙，根据GFP在蛙体内的表达情况，可以初步判断启动子的组织特异性。     

乳酸菌食品级基因表达系统的研究进展

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类可发酵碳水化合物,并产生大量乳酸的革兰 氏阳性细菌的统称[1],因其在食品工业中应用广泛且对人和动物无致病性,被公认为是安全级(generally regarded as safe, GRAS)微生物.与大肠杆菌、酵母菌相比,乳酸菌的分子遗传学的研究起步较晚.近年来,乳酸菌分子生物学及作用机制的研究取得了重 大发展,加之乳酸菌的模式菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的完整基因组已经测序完成 [2],这 为乳酸菌基因工程的发展和表达载体的构建奠定了基础,也为其在食品、医药工程及其改良 方面的应用提供了可能,因此乳酸菌食品级表达系统的构建及应用已成为该领域研究的前沿和热点.     

启动子Actinl的克隆及植物表达载体的构建

通过提取水稻叶片基因组DNA，设计PCR扩增特异引物，克隆单子叶特异表达启动子Actinl基因，与T载体连接，转化E．coliDH5α，得到重组子，经酶切和序列分析鉴定，该片段分子大小为1238bp，通过序列对比分析发现与已发表的Actinl碱基序列有99．60％的同源性。特异启动子基因驱动的抗真菌肽(AFP)基因植物表达载体，就可以进行早熟禾黑麦草等单子叶牧草的遗传转化，为单子叶牧草和草坪草的抗真菌病研究提供方法。     

乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。     

动物黏膜免疫疫苗基因表达系统一乳酸菌的研究进展

乳酸菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物.乳酸菌乳链菌肽诱导表达载体(Nisin controlled expression system,NICE)是近几年发展起来的一种表达系统,目前国内外学者利用乳酸菌NICE为载体来表达抗原蛋白研制黏膜免疫疫苗,刺激动物机体黏膜免疫系统产生高效的应答反应,试验证明抗原蛋白能在乳酸菌中正确表达,并能诱导机体产生分泌性抗体IgA(sIgA),同时激活机体系统免疫功能,具有重要开发前景.     

含鸡源启动子的真核表达载体的构建及IBV S1蛋白抗原表位的表达

利用PCR方法扩增出鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子基因序列,克隆至pcDNA3.1和pCIneo载体中以替代CMV启动子,获得含鸡源启动子的真核表达载体pcDNA-act和pCIneo-act。将IBV ZY3S1蛋白抗原表位基因亚克隆到启动子替换前后的质粒中,然后将重组质粒转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)中,采用间接免疫荧光试验检测转染细胞对S1蛋白抗原表位的表达。将重组质粒以150μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,同时设立IBV灭活疫苗组及PBS空白对照组,经间接ELISA检测免疫前后血清中IBV特异性抗体,最后使用ZY3强毒株给各组实验动物攻毒,观察鸡群的发病死亡情况,计算攻毒保护率。结果显示,替换启动子后的表达载体在CEF中对S1蛋白抗原表位的表达量以及实验动物的抗IBV抗体水平均高于未更换启动子的相应载体,攻毒后鸡群的发病率和死亡率均比替换前降低,说明外源基因的表达和启动子的来源有密切的关系。     

乳酸菌制剂的研究现状及在畜牧生产中的应用

乳酸菌制剂具有调节动物肠道菌群平衡,提高动物免疫力、生产性能等作用.目前,乳酸菌制剂在冻干保存、微胶囊制备及作为外源基因表达系统领域有了较多研究,乳酸菌制剂已广泛应用于猪、家禽和奶牛等畜牧生产.本文就乳酸菌制剂的研究现状及在畜牧生产中的应用作一综述,旨在为乳酸菌制剂在畜牧业中的进一步研究和应用提供参考.