广东省4株PCV2型分离株全基因组进化分析

【目的】了解目前广东省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)分离株的基因型和进化特征,为广东省PCV2防控及疫苗株的筛选提供参考依据。【方法】运用PCR方法将4份鉴定为PCV2阳性样品进行PCV2全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析;利用MegAlign软件对4株PCV2广东分离株ORF2氨基酸序列与国内外参考毒株进行关键位点氨基酸变异分析;应用DNAStar中Protean软件的Jameson-Wolf方法对4株PCV2广东分离株ORF2基因编码的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数预测分析。【结果】测序结果表明,4株PCV2广东分离株序列长度均为1 767 bp。遗传进化树结果表明,4株分离株均属于PCV2d基因型,且核苷酸相似性在97.7%～99.1%之间,与国内外54株参考毒株相似性在91.7%～99.8%之间,其中与PhuTho/G40312/2018株(Viet Nam,登录号：LC602996)、QZ1410株(江苏,登录号：MG732832)、GXBB1501211株(广西,登录号：MH756609)亲缘关系最为接近。关键氨基酸位点...     

猪流行性腹泻病毒陕西地方株的分离鉴定及序列分析

为了解陕西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化方向及为疫苗的研发奠定基础,采集陕西省部分地区腹泻仔猪的肠道及内容物,利用Vero细胞进行病原分离,扩增M基因和N基因序列并测序。结果显示病毒盲传5代,细胞出现收缩变圆直至脱落的细胞病变;序列分析结果表明,分离出的PEDV陕西地方株与其他参考毒株M基因核苷酸序列相似性为97.8%～99.7%,氨基酸序列相似性为97.3%～100%;N基因核苷酸序列相似性为95.7%～99.8%,氨基酸序列相似性为99.3%～100%。PEDV陕西分离株与CV777等经典株的亲缘关系较远,与变异株的亲缘关系较近。表明成功分离出PEDV陕西地方株,且均为变异株。     

犬细小病毒山东流行株分离鉴定及其全基因组测序分析

为了解山东地区犬细小病毒的流行及其变异情况,应用F81细胞从山东地区送检的发病犬粪便中分离出4株细小病毒,根据PCR和电镜技术对其进行鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆测序与序列分析。结果表明:所分离到的4株病毒均能在F81细胞上产生明显的细胞病变,经PCR及电镜观察鉴定为犬细小病毒,分别命名为QN1/QN2/QN3/QN4株。全基因组分析结果显示,除QN3株的基因组全长为4 756 nt外,其余3株均为4 757 nt;4个分离株之间全序列核苷酸同源性为99.31%,与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比对,同源性为98.2%⁹9.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%99.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%⁹9.9%,氨基酸序列同源性为98.1%99.9%,氨基酸序列同源性为98.1%¹00%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,同属于NewCPV-2a亚型。     

猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究

为了解河南地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行及变异情况,本研究从该地区某疑似感染PEDV的发病猪场采集粪便样品,经RT-PCR检测并测序,结果显示该猪场为PEDV感染。将阳性样品接种Vero细胞进行病毒分离,并通过RT-PCR扩增、测序及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果显示分离到一株PEDV,命名为HeN21株。经PCR分段扩增病毒全基因组,测序、拼接后的结果显示,该病毒基因组全长28 036 bp。为进一步分析HeN21株的遗传演化特征,利用MegAlign分析HeN21株全基因组与GenBank中5株PEDV参考株全基因组序列的相似性;采用MEGA 11软件中NJ法构建HeN21株与Gen Bank中31株PEDV参考株S基因的系统发育树;采用MegAlign分析HeN21株S蛋白氨基酸序列的变异特征;进一步评价HeN21株对哺乳仔猪的致病性。相似性分析结果显示,HeN21株与PEDV参考株的相似性为96.6%～98.9%,其中与经典GIa亚型代表株CV777的相似性最低为96.6%,与GIIa亚型代表株AH2012和GIIb亚型代表株AJ1102的相似性均为98.5%。进...     

两株死胎源猪圆环病毒Ⅱ型的分离与序列分析

将两猪场Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2)核酸阳性的流产死胎病料,接种猪肾传代细胞PK15,成功分离到2株PCV2。利用1对PCV2特异性引物,成功扩增出这2株PCV2长约1700bp的全基因组序列,并与其他PCV2毒株序列进行相似性比较。结果表明:2个分离株全基因组长度均为1767bp,核苷酸序列相似性为99.9%;ORF2基因核苷酸相似性为99.85%,所编码的衣壳蛋白氨基酸序列相似性为100%;2个分离株与SD-3等国内分离株核苷酸序列的相似性较高,最高可达99.9%。     

广东鹅源圆环病毒分子流行病学调查与毒株遗传进化分析

为了解广东地区圆环病毒在鹅群中的流行情况。研究针对鹅圆环病毒全基因组保守序列设计特异性检测引物,采用PCR方法对送检的232份鹅疑似鹅圆环病毒感染病例进行检测。并针对其中一份阳性样品病毒全基因组进行测序,获得该毒株全基因组序列信息。对该毒株全基因进行遗传进化分析、Cap蛋白相似性分析和B细胞抗原表位预测。结果显示,232份样品中阳性检出率为44.4%,表明鹅圆环病毒在广东地区鹅群中普遍存在,鹅圆环病毒毒株与其他已报道的鹅源毒株处于同一遗传进化分支,鹅源毒株间Cap蛋白相似性为98.0%~100%,但与鸭圆环病毒相似性低(46.9%~48.2%);Cap蛋白B细胞线性表位预测结果提示,鹅源和鸭源毒株表位位置相近,但氨基酸序列差异较大,提示两种毒株之间交叉保护力可能存在差异。研究为了解广东地区鹅源圆环病毒流行、进化情况,并进一步做好相关防控工作提供理论参考。     

犬细小病毒CPV-QD12株的分离鉴定与序列分析

本试验成功分离了1株犬细小病毒,采用PCR、理化特性检验、HA及HI等方法对其进行了鉴定,并对其编码区全基因序列进行了分析。取临床患出血性肠炎幼犬粪便经无菌处理后同步接种F81猫肾细胞分离病毒,盲传至第4代开始出现典型的细胞病变。该病毒可凝集猪的红细胞,血凝效价为28,可被犬细小病毒单克隆抗体特异性中和而产生血凝抑制现象;病毒效价为105.5TCID50/m L;毒株对氯仿和胰酶不敏感,且耐酸耐热。经病毒理化特性试验及犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制鉴定其为犬细小病毒,通过PCR检测及编码区全基因的扩增、测序和序列比较,证实所分离毒株为CPV-2a亚型,并将其命名为CPV-QD12株,与2013年分离自中国江苏省的CPV-2a型犬细小毒株CPV-JS2及2011年分离自中国广西的CPV-2a型毒株CPV-JQ686671.1的编码区核苷酸相似性为99.6%,具有较近的亲缘关系。该研究可为诊断和防控犬细小病毒病提供参考。     

四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型（PCV2）当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株（SMU-2022）的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%～99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。     

云南边境地区帕利亚姆血清群中山病病毒的分离与鉴定

【目的】了解西南边境地区牛感染中山病病毒(Chuzan virus, CHUV)的情况。【方法】应用BHK21细胞对云南景洪、江城采集的312份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,对出现细胞病变的毒株进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S7、S2基因序列测定和比对分析。【结果】4份血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳发现,4株分离毒株基因组为10节段,带型为“3-3-4”,与2012年云南师宗分离的CHUV SZ187毒株相似;4株病毒S7、S2基因核苷酸序列相似性分别为98.7%～99.7%和97.9%～99.1%;S2基因片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的SZ187、GHN-GS-16等毒株相似性最高;S7基因片段核苷酸和氨基酸序列与日本分离的ON-1/E/18、ON-3/E/17及中国本土的SZ187、GHN-GS-16等毒株的相似性最高。S7、S2基因遗传进化分析结果显示,4株新分离毒株亲缘关系最近;4株毒株的S7基因序列与中国本土和日本分离的已知帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup vir...     

犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析

为了对犬细小病毒临床分离株的VP2基因进行遗传变异分析,了解本地区犬细小病毒流行的优势型别及病毒变异情况。采集2例患犬细小病毒病的动物粪便,提取病毒基因组,设计特异性引物,PCR扩增VP2基因,对扩增产物测序,对序列结果与同属其他毒株VP2基因序列用MEGA 7和MegAlign进行同源性分析和遗传进化分析。同时比较其氨基酸变异情况。结果显示,PCR扩增出VP2基因,测序结果显示大小为1 755 bp,2株病毒VP2基因NCBI序列登录号分别为MH155192和MH155193, MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性为99.9%,MH155193与KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1核苷酸同源性为99.8%。MH155192主要位点氨基酸分别为为267Y,324I,370Q,426D,440A。MH155193主要位点氨基酸分别为267Y,324I,370R,426E,440T。且2株病毒297位均为A。表明分离到的2株病毒分别为新CPV-2b和CPV-2c型。     

犬细小病毒CPV-YH毒株的分离鉴定及其基因组变异分析

为分析当前犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)基因组遗传变异情况,本研究从细小病毒阳性患犬粪便中分离到一株病毒,经过病毒的形态学观察、血凝试验、动物回归试验以及分子生物学鉴定,分离的病毒确实为犬细小病毒,并命名为CPV-YH。病毒分离结果显示,病料接种A-72细胞能产生典型的细胞病变,病毒能凝集猪红细胞,在电子显微镜下呈圆形或六边形,无囊膜,直径约为20nm。动物回归试验复制出了犬细小病毒病典型症状:出血性肠炎、肝水肿、肺淤血。全基因组序列测定与分析显示,其基因组全长为4 921nt,与2011年兰州分离的CPV-LZ2分离株基因组相似性最高,为99%;VP2氨基酸进化树显示,CPV-YH分离株与2013-BJ-P27(中国)分离株和UY306(乌拉圭)分离株在同一个小的分支上。与GenBank上收录的CPV代表株的VP2基因比对,核苷酸和氨基酸相似性分别是98%~99.4%和97.1%~99.5%。以上试验结果表明,成功分离一株CPV变异株,这些数据将为CPV的流行情况和防控提供基础。     

北京地区猪圆环病毒3型感染的检测及基因组遗传变异分析

旨在了解北京地区猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传变异规律,为PCV3的防控提供参考依据。采集北京地区规模化养殖场73份临床表现为繁殖障碍和呼吸系统疾病的组织样品,对其中的PCV3进行检测和测序。根据PCV3全基因组序列设计3对特异性引物,从患PDNS的断奶仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列片段,克隆到pMD19-T载体中,经测序、拼接获得PCV3全长cDNA序列,利用DNAStar和DNAMAN生物软件对全基因组进行遗传变异分析。结果:北京地区PCV3感染率为30.1%(22/73),PCV3全基因组长2 000bp,GenBank序列登录号为MG546667,将该病毒命名为PCV3/CN/BJ-YH2016。其基因组有3个开放阅读框(ORF),其中两个ORF编码的蛋白与圆环病毒的复制相关蛋白(replication-associated protein,Rep)和衣壳蛋白(capsid protein,Cap)同源。PCV3/CN/BJ-YH2016与NCBI上30株PCV3基因组序列相似性为98.6%~99.3%,Rep蛋白氨基酸序列与美国毒株PCV3-US/MO2015(KX778720)的相似性最高(为100%),与中国毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016(MF589105)相似性最低(为95%),有16个氨基酸变异,全部集中在5-23位氨基酸。Cap蛋白氨基酸序列与美国毒株2164(KX458235)的相似性为100%,与其他毒株均有1~4个氨基酸发生变异,其中与PCV3-US/MO2015毒株相比变异位点分别位于24、26、56、100aa。以上试验结果表明,成功从患断奶仔猪多系统衰竭综合征仔猪体内克隆了PCV3全基因,并完成了序列分析,这些数据将为研究这种新型病毒——PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变（CPE）,电镜观察可见直径20 nm左右的病毒粒子,血凝效价1：256,PCR鉴定在570 bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620 bp,提交GenBank,登录号为：MF134808;该毒株与广东（SC02/2011）、深圳（CPV-s5）和甘肃（CPV-LZ1）等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析

为了解目前我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株基因组特征，本实验室于2020年从山东某养殖集团不同场区采集7份疑似感染PRRSV的组织样品，进行RT-PCR检测，将阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离病毒，利用间接免疫荧光试验(IFA)对分离病毒进行鉴定，经PCR对分离株全基因组序列分段扩增，采用生物信息学软件对分离株的ORF5基因及全基因组序列的同源性、NSP2氨基酸序列缺失特征和ORF5氨基酸变异位点及糖基化位点、ORF5基因与全因因组遗传演化关系分析以及全基因组的重组分析。结果显示：7份组织样品均呈PRRSV阳性，其中有6份阳性样品接种猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)后产生细胞病变，且通过荧光显微镜可观察到特异性绿色荧光，表明分离到6株PRRSV；对6株PRRSV的全基因组序列扩增、测序、拼接，通过全基因组序列同源性对比发现6株PRRSV全基因序列之间的同源性约99.4%～100%，表明6株PRRSV是同一来源，选择其中1株(SDlz0720株)进行后续分析。序列分析结果显示：SDlz0720株NSP2氨基酸序列均具有“111+1+19aa”的缺失特征，与NADC30-...     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变(CPE),电镜观察可见直径20nm左右的病毒粒子,血凝效价1∶256,PCR鉴定在570bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620bp,提交GenBank,登录号为:MF134808;该毒株与广东(SC02/2011)、深圳(CPV-s5)和甘肃(CPV-LZ1)等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析

分别将鹅细小病毒(GPV)的5个分离株通过PCR技术,从病毒基因组DNA中扩增出病毒蛋白VP1和VP3非重叠区的基因片段(VP13基因),并与pMD18-T质粒载体连接,转化到感受态大肠埃希菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,5株GPV VP13基因全长均为594 bp,编码198个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP13基因与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列相似性较高(93.4%～98.7%),但毒株间也存在一定差异。     

仔猪腹泻粪样中猪呼肠孤病毒的分离鉴定

通过在病毒培养液中添加胰酶的方法,笔者从仔猪腹泻粪样中分离并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生CPE,即以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的猪呼肠孤病毒SC-A株。在感染细胞中,病毒胞浆包涵体及特征性微管样结构明显,病毒粒子多呈典型的晶格状排列,直径约70 nm。克隆测序结果表明：SC-A S2全基因（DQ396805）大小为1 331 bp,其开放阅读框编码1个由418个氨基酸残基组成、相对分子量约为47.14 ku的σ2蛋白;与标准株T1L、T2J、T3D的核苷酸序列相似性分别为86.9%、76.7%、85.4%,推导氨基酸序列相似性分别为94.6%、93.3%、98.3%。在以σ2氨基酸序列构建的进化树中,标准株及野外分离株可被划分为A、B、C 3个大的进化分支;除T3C31外,其余3型野外分离株及SC-A株和所有血清1型病毒株均位于进化分支C中。     

狐源犬瘟热病毒HBF-1株全基因组序列测定及其分析

通过比对GenBank中已发表的21株犬瘟热病毒全基因组序列,利用Primer Premier5.0设计了首尾重叠的11对特异性引物,对1株适应Vero-dSlam细胞的犬瘟热病毒强毒HBF-1的全基因组进行RT-PCR扩增。将扩增获得的11个特异性目的片段分别连接到pEASY-Blunt载体,筛选出阳性克隆子。经过反复测序后,对11个片段的序列进行拼接最终获得了HBF-1株全基因组序列。利用DNAstar和MEGA6.0软件,分析HBF-1株与其他已公布CDV序列遗传进化关系。结果显示,适应Vero-dSlam细胞的犬瘟热病毒强毒HBF-1基因组全长为15 690 bp,与最初分离株Hebei株的同源性高达为99.8%,与国内黑龙江分离株HLJ-06的亲缘关系较近,同源性为98.5%,同经典疫苗株的亲缘关系相对较远,同源率为92.7%。HBF-1是分离株Hebei的Vero-dSlam细胞适应株,对二者基因编码区的序列比对,共出现13处氨基酸突变。其中,P蛋白突变率为0.39%,H蛋白突变率为0.33%,是2个变异率最高的结构蛋白。这些变异很有可能是病毒在适应Vero-dSlam细胞过程中形成的,但它们对HBF-1的致病性和毒力强弱是否存在影响,后续我们将深入研究。因此,开展细胞适应株HBF-1的全基因组序列测定及序列分析,对未来研究强毒株与Slam受体互作关系,及强毒株的致弱机制提供基础。     

一株新亚群禽白血病病毒全基因组序列分析

为了解外源性禽白血病病毒(ALV)在山东省部分地区肉鸡中的流行状况,采集无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞、ELISA p27抗原检测以及DNA提取进行PCR扩增等方法,从山东省某地区大型养殖场不同个体养殖场出栏肉鸡群中分离鉴定出1株ALV,命名为FC1505。分析其囊膜糖蛋白gp85氨基酸序列与近年来从地方品种鸡中疑似新亚群ALV-K分离株的相似性最高,相似性均在95%以上,而与其他已知亚群ALV的相似性均低于90%。为了进一步分析该分离株分子特性,对其进行全基因组测序,并与已知亚群ALV分离株序列进行比较。结果表明,FC1505分离株整个基因组中gag、pol和gp37基因相对保守,与ALV参考毒株序列相似性都在90%以上,但均与疑似K亚群的ALV分离株相似性最高;全基因组序列分析进一步说明FC1505属于ALV-K。本研究继我国江苏省和华南地区K亚群ALV报道后,首次从山东地区肉鸡中鉴定到一株ALV-K并完成其全基因组序列分析。     

猫细小病毒NS部分基因的克隆及序列分析

将疫苗用猫细小病毒(FPV)株提取基因组DNA,针对NS特定片段设计引物,利用PCR扩增出了部分基因并将该基因克隆到pMD18-T Vector中测序.结果表明,该基因长613bp,编码204个氨基酸.分离株基因与犬的细小病毒(CPV)、貂的细小病毒(MEV)毒株核苷酸同源性均为99%.氨基酸同源性达到97%、98%以上,与犬、貂的肠炎病毒有密切的亲缘关系.