一株H11N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解禽流感病毒在华东地区家禽体内的进化情况,作者对华东地区某活禽市场的家禽进行了禽流感病毒的流行病学监测,并分离鉴定出1株H11N2亚型禽流感病毒A/duck/Jiangxi/k0701/2009。对该株病毒全基因组的遗传进化分析表明A/duck/Jiangxi/k0701/2009的8个基因片段来源广泛,与亚洲及欧洲某些地区的毒株存在广泛的重组现象。其PB2基因和NS基因可能由A/mallard/Korea/GH170/2007(H7N7)提供,NA基因与高致病性禽流感病毒A/duck/Hebei/0710/2009(H5N2)的NA基因亲缘关系较近,而PB1、PA和NP基因则可能与A/Muscovy duck/Thailand/CU-LM1984/2009(H4N9)有共同来源。本研究结果提示该株病毒可能为1株多元重组病毒,且可能在高致病性禽流感病毒的进化中起了重要作用。     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的基因组测序及遗传进化分析

对2016年分离自华东地区某活禽交易市场的一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Anhui/D0642/2016(H6N6)进行了全基因组序列扩增和测序,以及序列同源性比对和遗传进化分析。结果显示,该分离株的HA基因与野禽源病毒A/turtledove/Wuhan/HKBJ62/2015(H6N6)的核苷酸一致性最高,推导的裂解位点处氨基酸基序为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因无茎部缺失,与早期分离株A/duck/Fujian/6159/2007(H6N6)具有最高的核苷酸相似性;内部基因中,仅NP基因与H6N2亚型禽流感分离株的核苷酸相似性最高,PB2、PB1、PA、M和NS基因均与近几年的H6N6亚型病毒关系紧密。进一步的分析表明,D0642株的8个基因片段均属于欧亚进化谱系,可能由H6N6和H6N2亚型重组产生;并且NA和PB2基因还与当前国内优势流行的2.3.4.4分支H5N6亚型禽流感病毒关系密切,可以为其在自然界的进一步重组提供基因片段的来源。因此,须加强对H6亚型禽流感病毒的流行病学监测。     

H6亚型鸭源流感病毒HA基因序列分析

为了研究H6亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的咽喉拭子样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H6亚型流感病毒,命名为A/duck/Heilongjiang/QG 1/2013(H6).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与我国鸭源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的同源性最高,达到97.8％.系统发育树分析进一步证实分离株与A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的亲缘关系最近,共同起源于台湾分离株A/chicken/Taiwan/G23/87 (H6N1).本研究为H6亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

一株鸭源H11N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析及对小鼠的致病性研究

为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性，本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示，分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF，符合低致病性AIV分子特征；HA蛋白²²⁶L和²²⁸S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示，H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支，其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高，而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示，该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制，表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上...     

一株鸟源H1N2型禽流感病毒全基因序列分析

2011—2012年,对我国广西活禽市场进行流行病学监测时从麻雀体内分离鉴定出1株H1亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)。为了解该株H1亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:这株分离纯化的H1N2毒株HA基因切割位点附近的氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,属于低致病力AIV的特征;NA基因与A/duck/Guangxi/GXd-2/2010(H6N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98%;PB1与PB2基因与H5和H4亚型较为接近;PA基因与A/duck/Guangdong/E1/2012(H10N8)同源性最高;NP基因则与A/chicken/Pakistan/NARC-16945/2010(H3N1)同源性达97%;而NS与MP基因分别与A/wild duck/Korea/SH5-26/2008(H4N6)、A/duck/Shanghai/C84/2009(H3N2)同源性最高。因此,推测A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)可能是不同来源的基因经过复杂重组演变后的1株重组病毒。     

H7N9亚型禽流感病毒的分布与遗传来源分析

2013年3月31日,国家卫生与计划生育委员会通报了上海和安徽确诊3例人感染H7N9亚型禽流感病例,顿时世界为之轰动,世界卫生组织（WHO）对此也高度关注。截止2013年4月25日,全国共确诊H7N9禽流感病例113人,分布在浙江、上海、江苏、河南等多个省份。历史上,美国、蒙古、韩国等多个国家都曾从野鸟和水禽中检出过H7N9亚型禽流感病毒,但从未有过人感染发病的报道。这次发生首次展现了H7N9具有夸宿主传播的能力。病毒基因组遗传进化分析表明这次流行的H7N9亚型禽流感病毒不同于以往的任何一株H7N9病毒,其HA 基因与我国南方水禽近年来分离到的H7亚型禽流感病毒密切相关,NA 基因则与2011年韩国野鸟分离到的H7N9亚型禽流感病毒遗传关系较近,其余6个基因则与国内地方流行的H9N2亚型禽流感病毒高度同源。因此,该病毒可能是不同亚型禽流感病毒在同一宿主体内经二元或三元重排而形成的新病毒。本文就H7N9亚型禽流感病毒的历史分布和国内新出现的H7N9亚型禽流感病毒的分子特性和遗传进化进行了分析。     

2013—2014年H7亚型禽流感病毒遗传进化分析

对2013—2014年15株不同来源的H7亚型禽流感病毒国内分离株进行了基因组测序与遗传进化分析。结果显示,15株H7亚型禽流感病毒具有遗传多样性,可分为2种亚型:13株为H7N9亚型,2株为H7N3亚型。HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示所有H7亚型流感分离株均为低致病性毒株。基因组遗传进化分析显示,13株H7N9亚型禽流感病毒均与2013年人源分离株同源性较高,但具有2种遗传学特性,13株病毒的PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因高度同源,而PB1基因来源于2个不同分支。2株H7N3亚型流感病毒与国内鸭源分离株同源性较高。15株H7亚型禽流感病毒PB2蛋白均未出现627K、701N等与哺乳动物适应性相关的氨基酸变异。13株H7N9亚型禽流感病毒HA裂解位点附近氨基酸(EIPKGR/GL)与人源H7N9病毒一致,且HA蛋白和M2蛋白分别具有与哺乳动物适应性和金刚烷胺耐药性相关的标志性变异,而2株H7N3亚型禽流感病毒未出现上述氨基酸变异。     

1株H6N5亚型禽流感病毒A/duck/Yangzhou/013/2008的全基因测序及遗传进化分析

在对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行流行病学监测的过程中,采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法,分离鉴定出1株H6N5亚型禽流感病毒A/duck/Yangzhou/013/2008(简称Dk/YZ/013/08)。为了探讨该亚型病毒在流感病毒生态分布中的作用,作者对Dk/YZ/013/08进行了全基因序列测定,并结合Gen-Bank中已收录的所有H6N5亚型病毒的基因组序列及其它参考序列进行了遗传进化分析。结果表明Dk/YZ/013/08的血凝素基因(HA)与近年中国台湾分离的鸭源毒株A/duck/Kingmen/E322/2004(H6N2)的核苷酸一致性最高(94%),推导的氨基酸剪切位点序列为"P-Q-I-E-T-R-G",为典型低致病性禽流感病毒的特征序列;神经氨酸酶基因(NA)与瑞士分离株A/mallard/Switzerland/WV4060167/2006(H3N5)的亲缘关系最近(核苷酸一致性96.9%);而碱性聚合酶2(PB2)基因则与A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)的遗传距离最近,可能由H5N1亚型流感病毒提供,提示该毒株可能是一株重组病毒。     

2019—2021年华东地区6株禽源H3亚型流感病毒的遗传进化分析

H3亚型流感病毒在自然界广泛存在,可感染人、猪、马、犬、禽等众多宿主并能发生跨种间传播,危害不容忽视。本研究于2019—2021年在华东地区活禽市场采集表观健康的家禽喉头与泄殖腔棉拭,通过血清学试验鉴定、筛选出6株代表性水禽源H3亚型流感病毒,并经RT-PCR试验确定5株为H3N2亚型、1株为H3N1亚型。进一步对6株分离株进行全基因组测序、同源性比对和遗传进化分析,结果显示：HA蛋白裂解位点处均为PEKQTR/GLF,不存在连续碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;受体结合位点处均为禽源特征性的226Q和228S,提示其跨种传播至哺乳动物的潜能较低;内部基因片段来源多样化,与H3N8、H4N6、H5N8、H6N1、H7N7、H0N3等众多亚型禽流感病毒的亲缘关系密切;除JS1018/19和JS1094/19的NS基因属于北美谱系以外,其余均属于欧亚谱系的禽源分支,与犬、马、猪、人等哺乳动物源毒株的亲缘关系较远,提示虽然可能存在不同进化谱系间的基因重组但并未发生从禽到哺乳动物宿主的基因交换。该研究结果丰富了H3亚型禽流感病毒的流行病学数据,为进一步了解我国低致病性禽流感病毒的分...     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的遗传进化及致病性分析

为了解H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的遗传进化及致病特点,本研究对一株从健康三穗鸭体内分离鉴定的H6N6亚型AIVA/Sansui Sheldrake Duck/Guizhou/013/2014(H6N6)进行部分生物学特性测定、全基因组测序与遗传进化分析及动物感染试验。结果表明:分离株的HA裂解位点"339PQIETRG345"为非连续性的碱性氨基酸,其MDT为98.4 h,ICPI为0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST结果显示该分离株HA基因与A/chicken/Hunan/S41912/2009(H6N2)的核苷酸同源性最高(97.1%);NA基因与A/duck/Eastern China/48/2010(H6N6)的一致性最高(97.0%);而PB2基因与A/muscovy duck/Vietnam/LBM755/2014(H5N6)的同源性达96.9%,M基因和NP基因则分别与A/duck/Jiangsu/4/2010(H3N6)和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)同源性最高。动物感染试验结果表明,感染鸭不表现明显的临床症状,咽喉和泄殖腔不存在排毒现象;鸭子感染后的第3 d、5 d及7 d部分组织脏器中可以检测到病毒复制,但病毒含量并不高。以上研究结果表明,贵州省内分离到的H6N6亚型AIV是一株弱毒株,其基因组可能是由H6N2、H5N6、H3N6、H5N1等多个亚型病毒重组而成。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒(AIV)在广西中越边境地区的流行情况,本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6),对其HA和NA基因进行序列测定,并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示,分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)的核苷酸同源性最高(96.9%),NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)的核苷酸同源性最高(98.2%)。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒分子特征;与部分N6亚型禽流感病毒一样,分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外,本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定,结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2,3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6)是一株重组低致病性禽流感病毒。     

一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析

本研究对2014年从新疆额敏县分离到的一株野鸟源H3N8亚型流感病毒A/wild bird/Xinjiang/S3525/2014(H3N8)进行了全基因序列和进化分析。序列分析显示,HA裂解位点序列为~(339)PEKQTR-GLFG~(348),为典型的低致病性禽流感病毒特征,NA基因具有6个潜在的糖基化位点,与病毒株A/mallard/Czech Republic/14333-1K/2011(H3N8)核苷酸高度同源(97.7%)。该毒株的内部基因来源较复杂,其PB1、NP基因分别与A/ruddy shell duck/Mongolia/921C2/2009(H7N1)和A/wild duck/Korea/MHC39-26/2011(H7N9)的同源性最高,其余内部基因与H2、H3、H6、H7等亚型禽流感病毒分离株同源性最高,呈现明显的异源性。除PB2基因外,其余基因片段均来源于野鸟源禽流感病毒。     

一株H4亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传演化分析

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定一株H4亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(缩写为DK/GX/912/08)。为了解该株H4亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:DK/GX/912/08HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于东半球谱系的欧亚分支;NA基因与A/duck/Jiangxi/1286/2005(H5N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98.1%;PB2基因与A/duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)处于同一分支;而NS基因与A/duck/Jiangxi/1786/03(H7N7)同源性最高。因此,推测DK/GX/912/08可能是不同来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

鸭源H6N6禽流感病毒贵州株NS基因的克隆及序列分析

为明确贵州地区鸭群中H6N6亚型禽流感病毒(AIV)中非结构蛋白基因(NS)系统进化情况,试验于2014年从贵州省健康三穗鸭体内分离鉴定出的一株H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Guizhou/013/2014(DK/GZ/14),对其禽流感病毒NS基因进行扩增,并克隆到p MD-18T载体中测序,获得NS蛋白的完整编码序列;同时将NS核苷酸序列与Gen Bank中已有的参考序列作比对。结果表明:DK/GZ/14的NS基因与江西毒株2009年鸭源H6N6亚型禽流感病毒同源性最高,达99.5%;由遗传进化树可知,NS基因在遗传进化关系上与2009年广西分离株位于同一分支,而与2005年分离的汕头毒株不处于同一分支,DK/GZ/14与邻省的H6N6毒株亲缘关系较近。     

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。     

1株野鸟源H7N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠感染性研究

旨在对2021年分离自我国宁夏回族自治区野鸟粪便中的1株低致病性H7N3禽流感病毒(AIV)A/mallard/Ningxia/Y37/2021(H7N3)株进行了全基因组测序、遗传进化分析及对小鼠致病性试验。全基因组序列分析表明，HA基因裂解位点仅有1个碱性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特性。遗传进化分析结果表明，HA基因和韩国野鸭源H7N7亚型AIV同源性较高；NA基因与韩国野鸟源H5N3亚型AIV同源性较高；PB2、PA基因与H5N2亚型AIV有较高的同源性；PB1基因与H5N3亚型AIV有较高的同源性；NP基因与H3N2亚型有较高同源性；M、NS基因与H3N8亚型有较高同源性，具有明显的遗传多样性。血凝抑制(HI)试验结果表明，该毒株与H7N9-Re4疫苗株抗血清的HI效价比同源毒株低16倍，抗原性差异显著。小鼠感染性试验结果显示，该病毒能在小鼠的肺部与鼻甲中复制，并引起感染小鼠体重下降，表明该毒株有感染哺乳动物的风险。本试验通过对1株野鸟源H7N3亚型AIV部分生物学特性的分析，为H7N3亚型禽流感的预警和综合防控提供重要理论参考。     

H3N2亚型猪流感病毒重庆株的分离、鉴定、基因组测定及序列分析

从猪流感疑似病例中分离鉴定猪流感病毒,并对病毒进行全基因组测序及其序列的分析。采用鼻棉拭子法从猪流感疑似病猪的鼻中收集病样,制成病毒悬液,经SPF鸡胚增殖培养和纯化。采用红细胞凝集、血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验进行病毒亚型的判定,并作电镜观察。运用RT-PCR法扩增病毒的8个基因片段,分别克隆到pMD18-T载体,进行全基因组测序及序列分析。结果表明,获得1株猪流感病毒,经血凝、血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验,判定为H3N2亚型,命名为A/swine/Chongqing/CQ/3/2011(H3N2),简称SIV CQ3。基因组序列比较分析显示,SIV CQ3 8个节段与不同时间的猪流感广东分离株(H3N2亚型)相应基因的核苷酸相似性最高,可能来源于H3N2亚型SIV。然而NP、HA和NA基因编码氨基酸序列与参考毒株A/New York/392/2004(H3N2)的相似性比较低,分别达95%、89%和90%;而血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-E-K-Q-T-R↓G,与参考毒株的一致,不具有高致病分子特征。此外,HA和NA的糖基化位点、受体结合位点处氨基酸存在一定程度的差异。最后,系统进化树分析显示NP、HA基因位于SIV群,与A/swine/Guangdong/2006/(H3N2)处于同一分支;而NA基因与禽流感(A/duck/Ontario/2000/AJ697881)和猪流感位于同一个进化单元,表明这株H3N2亚型流感病毒在不断的发生演变。     

H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/Heilongjiang/301/2007非结构蛋白基因全序列扩增及分析

2007年秋我们从迁徙水禽绿头鸭(Anas platyrhynchos)中分离出一株H6N1亚型低致病性禽流感病毒A/Mallard/Heilongjiang/301/2007.通过设计特异性引物对其非结构蛋白基因(NS)进行了全序列的扩增,并在GenBank中的序列进行比较,发现A/Mallard/Heilongjiang/301/2007属于欧亚系禽流感病毒,此株病毒NS基因与duck/Hokkaido/Vac-1/2004 H5N1株NS基因同源率高达98.5%,可能与北海道地区禽流感病毒具有共同起源.另外此株病毒NS基因在263～277位并没有发生15碱基的缺失,所以应属于等位基因A,亚系Ⅰ型.     

2株H11N3亚型禽流感病毒厦门分离株的基因特征及遗传进化分析

从厦门地区健康鸭群和环境中分离到2株H11N3亚型禽流感病毒(简称SD61和XA33),对其进行全基因组序列测定、遗传演化分析和特殊位点的氨基酸分析。结果显示:2株分离株的HA裂解位点均符合低致病性禽流感病毒特征,NA颈部均无缺失碱基;内部基因中M1基因N30D、T215A突变,PB1基因发生S622G突变,NS1均存在PL基序,为ESEV,SD61株中NS1发生P42S突变,提示当前分离株已出现致病性增强的变化。8个基因片段均属于欧亚谱系,除了HA基因外,与A/duck/Fujian/SD063/2017(H3N3)毒株其他7个基因片段有高度的同源性,同时与浙江、江西、江苏等不同亚型禽流感病毒同源性很高,说明这2株H11N3毒株发生基因重组现象。本研究结果将为本地区禽流感病毒生物学特性研究和防控提供科学依据。