海兰鸡内源性白血病病毒位点序列鉴定与分析

鉴定和比较海兰鸡基因组中内源性禽白血病病毒(ALV)位点。使用超嗜热古菌Thermococcus sp.4557来源重组表达的Pol B DNA聚合酶,通过一次PCR反应从海兰鸡的基因组DNA中扩增到了包括gag、pol、env基因部分片段及3′-LTR的内源性ALV位点,将其命名为HL-E1。序列比较表明,其env基因与E亚群内源性ALV高度同源;与完整的ALV基因组相比,其gag、pol、env三个主要功能基因分别缺失了93、1 960和805个碱基。海兰鸡基因组中存在4 663bp的缺陷型ALV基因组片段,其env基因和LTR都与鸡基因组上经典的ev1位点的相应基因有96.8%和97.4%的相似性,表明这是整合进海兰鸡染色体基因组中的一个内源性E亚群ALV片段构成的ev位点,这是又一个ev位点的全序列报道。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒(ALV)贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为:GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%～97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%～99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%～53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

七彩山鸡F亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

为了解广东某七彩山鸡种禽场禽白血病流行情况,通过接种DF-1细胞、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)、囊膜基因克隆测序等方法分离并鉴定出两株ALV-F,分别命名为FGD1801和FGD1802。为进一步了解分离株遗传进化特点,利用PCR方法扩增出env基因并测序,同时与各亚群参考毒株的gp85核苷酸序列进行对比。结果显示:这两个分离株env基因gp85片段长度都为1080 bp,预计编码360个氨基酸,FGD1801和FGD1802分离株gp85基因核苷酸序列的相似性为92.8%,与A、B、E、J和K亚群共26株ALV参考毒株相似性在47.0%~64.5%之间,而与F亚群参考株的相似性在92.0%~92.5%,显著高于其他亚群,且位于同一进化分支上。研究表明,从七彩山鸡分离的FGD1801和FGD1802属于ALV-F,是我国华南地区新发现的ALV亚群。     

禽白血病病毒基因选择压力分析

以禽白血病病毒(ALV)A、B、E和J四个亚群的部分毒株为研究对象,基于env、gag和pol三个编码基因的核苷酸序列,运用DAMBE、Mega和Paml等生物学软件,对ALV分子演化过程中所承受的选择压力进行检测分析,发现env、gag、pol基因承受的选择压力总体趋势为净化选择压力,而env、gag和pol蛋白检测出正选择位点数量分别为19个、8个和5个,说明env蛋白存在较大的正选择压力,进一步证明了env基因具有高度变异的特点。     

J亚群与E亚群禽白血病自然重组病毒的全基因组序列分析

为了解我国东北地区部分养鸡场禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其变异情况,本研究从具有典型血管瘤病变的禽白血病发病鸡中分离到一株J亚群ALV(ALV-J)命名为JL0901,并进行了全基因测序.将该序列与已发表的ALV-J毒株序列进行比较研究,结果表明JL0901基因组的gag和pol基因相对保守,而env基因和3'端非编码区(3'UTR)的变异较大.对JL0901的env基因核苷酸序列进一步分析发现,在其gp85基因和gp37基因交界位置发生J亚群和E亚群ALV重组现象.本研究证实国内鸡群中存在J亚群和其他亚群ALV的自然重组现象,并表明国内ALV已出现新的变异趋势.     

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列AL V-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析.结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病.通过分析可见,AL V-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2％～96.6％之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异.但与ALV J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来.与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远.     

禽B型白血病病毒的分离及分子分型鉴定

从送检的骨石症蛋用种鸡中分离出一株禽白血病病毒(ALV)。剖检骨石症发病鸡,采集病变的肝脏、脾脏组织,提取病毒基因组,并利用针对ALV群特异性抗原P27基因设计的引物进行PCR快速检测确定为ALV感染。将病变组织接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜,连续传代3次。进一步针对亚群间特异性抗原gp85区设计一对引物进行PCR扩增并酶切分析。结果确认分离到的1株病毒为ALV-B亚型。     

禽白血病病毒p27基因的原核表达及生物信息学分析

为了进一步研究禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27蛋白的结构与功能,并获得具有反应原性的重组蛋白p27,试验通过PCR技术克隆p27基因,构建克隆载体pMD19-T-p27,并应用生物信息学软件对获得的p27基因序列进行分析,构建重组表达载体pET-28a-p27,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot对获得的重组蛋白p27进行分析。结果表明:通过PCR技术克隆获得ALV p27基因,并成功构建了克隆载体pMD19-T-p27;生物信息学分析发现,p27蛋白由239个氨基酸组成,分子式为C_(1140)H_(1853)N_(323)O_(339)S_6,理论等电点为6.23,无信号肽和跨膜区,含有8个丝氨酸磷酸化位点和13个苏氨酸磷酸化位点,无糖基化位点,共有9个抗原表位,二级结构和三级结构中以α-螺旋为主;成功构建了重组表达载体pET-28a-p27,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达;诱导6小时时蛋白质表达量最大,分子质量约为27 ku,且以可溶性为主;重组蛋白p27具有较好的反应原性和特异性。说明试验获得了具有反应原性的重组蛋白p27,为建立禽白血病快速诊断方法和新型疫苗的研发提供了理论基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的生物信息学分析

为了分析鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的蛋白质结构以及预测其作为疫苗候选抗原的可能性,试验采用蛋白分析专家系统(Ex PASy)、DNAMAN、DNAStar、Gene Runner等生物信息学软件,对SAG17的开放阅读框、理化性质、信号肽、二级结构、跨膜结构域、亲/疏水性、修饰位点以及抗原表位等进行分析与预测。结果表明:SAG17全长813 bp,其蛋白由270个氨基酸组成,理论分子质量为28 741.23 u,分子式为C1252H1979N339O411S12,原子总数为3 993个,等电点为4.81,含有7个丝氨酸磷酸化位点、16个苏氨酸磷酸化位点、2个酪氨酸磷酸化位点、7个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点、2个赖氨酸ε-氨基糖基化位点、1个GPI修饰位点、4个SUMO蛋白附着位点、13个潜在的抗原表位、4个跨膜区,无信号肽。在SAG17基因中α螺旋占44.44%,β转角占10.00%,无规卷曲占32.59%,延伸链占12.96%,含有13个抗原表位。说明SAG17具有潜在的免疫原性,可用于研制安全、高效的球虫疫苗。     

内源和外源性禽白血病病毒鉴别PCR检测方法的建立

为建立简单快捷的内、外源性禽白血病病毒(ALV)的鉴别检测方法,本研究根据外源性ALVA亚群标准株RAV-1的p27、env基因以及内源性ALVE亚群标准株ev1的env基因的保守序列,设计3对特异性引物,可分别对ALV、外源性ALV(A、B亚群)和内源性ALV(E、J亚群)进行扩增,扩增产物分别为793bp、387bp和234bp,通过对各反应条件的优化建立了同时检测并鉴别内、外源性ALV的多重PCR方法。该方法特异性良好、灵敏度可达到2×103copies,利用该方法和ELISA对5份现地病鸡组织样品和10枚疑似感染内源性ALV的鸡胚进行检测,结果表明:4份病鸡样品均扩增出3条特异性片段;而9枚鸡胚仅扩增出793bp和234bp的特异性片段,2种检测方法的符合率为100%。该方法为内、外源性ALV的临床鉴别诊断奠定了基础。     

1株诱发血管瘤的ALV-J的分离鉴定及其囊膜基因的进化分析

【目的】了解湖北某黑羽蛋鸡场J亚群禽白血病(J-avian leukosis)的来源及其囊膜基因进化趋势,为湖北地区禽白血病流行病学调查提供资料。【方法】运用病理学、ELISA和Multi-PCR方法对疑似血管瘤型J亚群禽白血病病毒(J-Avian leucosis virus, ALV-J)病例进行实验室诊断,制备病毒液接种DF-1细胞进行病毒分离及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测,并通过DNAStar等软件分析该毒株囊膜蛋白编码基因。【结果】病例呈现典型血管瘤病变,p27抗原检测呈阳性,Multi-PCR出现ALV-J特异性条带,IFA结果显示特异性荧光,表明分离到1株ALV-J,命名为HB2021017。分离株HB2021017囊膜蛋白ENV、膜表面糖蛋白SU、跨膜蛋白TM与所引用的ALV-J毒株中的髓细胞瘤型毒株、髓细胞瘤和血管瘤混合型毒株、血管瘤型的ALV-J毒株的氨基酸序列相似性逐步升高。系统进化树分析显示,分离株HB2021017的env基因与中国地方品种鸡群中分离的诱发血管瘤的ALV-J毒株亲缘关系最近...     

40周龄三黄种鸡爆发禽白血病的诊断与病原分析

为了解鸡群中禽白血病(Avian leukosis,AL)发生的原因以及感染的禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的亚群,研究对发病鸡进行临床诊断、病理剖检和病理组织学观察,并采集肿瘤样病变组织处理后接种DF-1细胞,培养后分别进行禽白血病病毒p27群特异性抗原ELISA检测、亚群特异性PCR检测以及亚群特异性间接免疫荧光法(IFA)鉴定,确定了40周龄三黄种鸡群感染了J亚群禽白血病病毒(ALV-J,分离株命名为GX16YL02);进一步对分离株env基因进行PCR扩增、克隆和序列测定与比较分析。结果表明:分离株GX16YL02的env基因与ALV-J英国原型株HPRS-103的核苷酸及氨基酸的相似性分别为93.9%和91.9%,与其他8株国内外参考株的核苷酸及氨基酸的相似性分别为90.7%~95.5%和89.4%~95.2%,其中gp85基因与其他参考株的核苷酸和氨基酸相似性相对较低,分别为86.9%~94.9%和85.1%~95.4%,整个env基因有义突变和沉默突变的比例分析显示,与gp37基因相比,gp85基因变异较大,尤其是免疫选择压在高变区hr1区域有一定的作用。     

山羊痘病毒069蛋白的表达与结构分析

为了分析山羊痘病毒THx株069基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本试验应用PCR技术对069基因进行扩增,并构建原核表达载体,经测序鉴定后用IPTG诱导表达其蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。用DNAStar及Mega软件对GenBank登录的24个该基因参考序列进行同源性比对并作遗传进化树分析;同时采用生物信息学分析方法对069蛋白信号肽、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、抗原决定簇、亲水性、二级及三级空间结构进行预测。结果表明:GTPV-069号基因全长为573 bp,与参考株GTPV-pellor相似度高达97.19%,经同源性比对与遗传进化树分析发现,山羊痘病毒THx株069基因序列与绵羊痘亲缘关系较近,在同一分支上,与疙瘩皮肤病和其他山羊痘亲缘关系较远。SDS-PAGE鉴定表明069蛋白大量表达于上清中,条带清晰。Western blot结果证明069蛋白与His标签确实进行了融合表达;生物信息学分析发现GTPV-069蛋白无信号肽、含有跨膜结构,跨膜区在29～51 aa之间,为典型的膜蛋白。069蛋白含有8个抗原决定簇、1个糖基化位点和14个磷酸化位点。二级结构分析显示,069蛋白中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占43.46%,25.65%,23.04%和7.85%,三级结构预测发现069蛋白以α螺旋为主。本试验为后期探究羊痘病毒其他部分生物学功能以及新型羊痘疫苗的研制提供了依据。     

肉种鸡群中J亚群禽白血病的危害和净化

1.病原及临床症状 J亚群禽白血病(subgroup J Avian Leukosis)是由J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)引起的一类禽类传染性肿瘤疾病,病原属于反转录病毒,与过去已经发现的ALV亚群A、B、C、D、E中的任何一种都不相同,ALV-J核衣壳的蛋白质由gag基因编码,包括主要的群特异性抗原;包膜由env基因编码;逆转录酶由pol基因编     

茶花鸡2号IFN-α基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆茶花鸡2号α干扰素基因（IFN-α）CDS区序列并进行生物信息学分析,为后续研究IFN-α基因对茶花鸡2号免疫功能的影响提供参考。以茶花鸡2号为实验对象设计IFN-α引物,提取总RNA,反转录PCR扩增并克隆其编码区序列,进行生物信息学分析。结果显示茶花鸡2号IFN-α基因CDS序列全长582 bp,IFN-α蛋白等电点5.05,平均疏水指数-0.514,为酸性亲水蛋白,且存在信号肽和1个跨膜区,主要定位于细胞核。IFN-α蛋白被4个N糖基化位点、5个O糖基化位点和20个磷酸化位点修饰,主要由α-螺旋与无规卷曲构成。茶花鸡2号与固始鸡、海兰鸡、惠阳胡须鸡、罗曼鸡和乌骨鸡的氨基酸同源性分别为95.9%、97.9%、97.9%、97.9%和95.9%。IFN-α蛋白与IRF7、IFNAR1、IFNAR2和IFNK等蛋白存在互作关系。本研究结果可为进一步探讨IFN-α基因在茶花鸡2号病毒疾病防治中的作用提供理论依据。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒（ALV）贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为：GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%~97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%~99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%~53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

3个江西地方鸡品种的禽白血病病毒病原学调查

对来自江西3个地方鸡品种(崇仁麻鸡、余干乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡)进行禽白血病病毒(ALV)病原学调查。将所采集的血浆接种DF-1细胞,经ALV p27抗原ELISA检测,结果显示这3个江西地方鸡品种均有外源性ALV感染,经鉴定得到4株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)。基于gp85序列分析表明这4个分离株与ALV-J英国原型株HPRS-103 gp85基因核苷酸序列相似性最高(平均为94.6%),而与A、B、C、E亚群ALVgp85基因的核苷酸相似性仅在50.6%~54.5%之间。这是江西地方鸡品种分离和鉴定ALV-J的初次报道,对于我国江西省地方鸡品种的禽白血病净化具有参考价值。     

鸡白血病检测技术研究

1 鸡J亚群白血病病毒env基因的克隆和表达 鸡白血病病毒(ALV)env基因编码的囊膜蛋白,位于病毒表面,其与宿主细胞受体相互作用,是亚群表型的决定因素.为研究ALV-J env基因及其表达产物特点,为ALV-J的检测奠定基础,本实验室对ALV-J env基因进行了克隆和真核表达.值得注意的是,在设计env基因引物时,需将env基因前的信号引导序列包涵其内.     

我国东北地区野生鸟类A亚群禽白血病病毒分子流行病学调查及env基因序列分析

为了解野生鸟类禽白血病病毒(ALV)的感染情况,本研究采集了300份野生鸟类样品,将样品处理后接种DF-1细胞,利用p27抗原ELISA、IFA、PCR等方法检测,其中两份样品为ALV阳性并对其env基因扩增.结果表明,其中gp85编码序列与已发表的A亚群ALV (ALV-A)的同源性最高,为91.1％～100％,而与已发表的鸡的B、C、D、E、J亚群ALV的gp85编码序列的同源性仅在28.0 ％～80.3％之间.遗传进化树分析也表明这两份ALV阳性样品的gp85编码序列属于ALV-A.本实验在我国野生鸟类群体中首次分离和鉴定出ALV-A,表明目前我国野生鸟类已经存在A亚群ALV的感染.     

弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1(Tg MAPK1)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等。结果表明:该基因全长为1 772 bp,编码区为133~1 731 bp,编码532个氨基酸。编码蛋白性质稳定,理论分子质量为58.376 ku。Tg MAPK1蛋白有5个跨膜区,有3个N端糖基化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个环腺苷酸蛋白激酶磷酸化位点、10个N端肉豆蔻酰化位点及1个酰胺化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;Tg MAPK1基因主要存在于弓形虫虫体外膜上,有20个潜在的抗原表位。说明弓形虫Tg MAPK1基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。