乌珠穆沁羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP检测及序列分析

利用PCR-SSCP技术检测乌珠穆沁羊123个样本的FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性（SNP）。结果未发现多态。测序后获得该羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列,通过DNA序列分析结果表明：绵羊FSHR基因第10外显子序列与小尾寒羊、牦牛、水牛和小鼠的同源性分别为100%、98%、98%和86%。提示：为FSHR基因第10外显子能否作为绵羊高繁殖力相关的侯选基因提供依据。     

海门山羊FSHR基因外显子10的PCR—SSCP分析

对海门山羊抽样群体FSHR基因的EXON10部分序列进行PCR-SSCP基因型判定,发现两种基因型:HK型和HH型。HK基因型频率为0.925,HH基因型频率为0.075,基因H的频率为0.5375,基因K的频率为0.4625。HK基因型个体数远远高于HH基因型个体数。对不同基因型个体测序,发现第90位有单碱基C→T,HK型个体为C,HH型个体为T。对抽样群体进行统计学分析,发现野生型HK基因型海门山羊产羔数比突变纯合型HH基因型多0.34只(P<0.05),K等位基因与海门山羊产羔数呈显著正相关。     

牛FSHR基因第4外显子多态性检测及序列分析

以西门塔尔和夏洛莱种公牛为对象,采用PCR-SSCP技术检测了促卵泡素受体(FSHR)基因第4外显子在西门塔尔、夏洛莱种公牛45个个体中的遗传多态性,结果发现多态性,旨在为研究该基因多态性与西门塔尔和夏洛莱种公牛繁殖性状的相关性提供理论依据,为筛选繁殖性状分子标记奠定基础.结果表明,牛FSHR基因第4外显子存在2个等位基因A和B,3种基因型分别为AA型、AB型和BB型.对多态片段的测序分析表明,FSHR基因第4外显子第38位碱基处发生碱基C→G的颠换,使得FSHR基因编码的受体胞外域部分出现一个脯氨酸到丙氨酸的变化,结合FSHR蛋白空间结构分析发现该氨基酸变化不直接影响FSHR与FSH的结合及FSHR转导信号能力.此外,据牛、绵羊、猪、马、人和大鼠FSHR基因第4外显子序列同源性比较表明:牛与绵羊该部分序列的同源最高为100%,与大鼠同源性最低为83%.     

通过PCR-SSCP检测乌珠穆沁马ELA-DQA第二外显子的多态性

实验通过PCR-SSCP技术检测了50匹中国乌珠穆沁马的ELA-DQA第二外显子。结果表明:50匹乌珠穆沁马中共出现11种基因型:5种纯合子分别记为AA、BB、CC、DD和EE型,其中AA型为单带;其余4种纯合子均为3条带;6种杂合子分别记为AB、AC、AD、AE、BD和BE型,带型不一,其中A、B、C、D和E等位基因频率分别为0.28、0.25、0.11、0.16和0.20。这表明乌珠穆沁马ELA-DQA第二外显子多态性丰富。     

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。     

蒙古马生长激素基因的克隆及部分序列的PCR-SSCP分析

通过PCR-SSCP方法对7个品种285匹马的生长激素基因做了多态性分析,在所检测的5′端侧翼区、第一内含子、第二外显子和第五外显子4个位点中,仅第五外显子检测到多态,该多态位点由A和B两种等位基因控制.GH基因第1 719处1个T→C的突变和1 743处G→A的突变,导致等位基因B变为等位基因A.除纯血马外,A基因在各品种中均为优势等位基因,B基因为纯血马的优势基因.在此多态位点,乌珠穆沁马、乌审马和巴尔虎马处于Hardy-Weinberg平衡状态,纯血马、三河马和锡尼河马则未达到Hardy-Weinberg平衡状态.     

欧拉型藏羊GH基因部分序列PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP方法,检测126只欧拉型藏羊GH基因第1、2内含子、第1～4外显子序列的遗传多态性,结果表明:仅第4外显子出现多态性,存在2个等位基因3种基因型(AA、AB和BB),BB基因型频率最高,B等位基因频率明显高于A等位基因频率,其余位点未检测到多态.群体遗传学分析结果表明:该群体在这一位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),多态信息含量(PIC)为0.231 3,为低度多态(PIC＜0.25).测序结果显示:与藏绵羊GH基因序列(EFU77162)相比,B等位基因在1 286bp处发生T→C的突变,该突变为同义突变.     

甘南欧拉羊GHR基因第10外显子SSCP多态性与生长性状关联研究

采用PCR-SSCP技术对120只甘南欧拉羊GHR基因的部分序列进行了多态性研究,分析了该基因与藏羊生长性状的关联性.结果表明:欧拉羊GHR基因外显子10存在2个等位基因和3种基因型.在该基因座上,欧拉羊呈Hardy-Weinberg平衡状态.3种基因型与甘南欧拉羊部分生长性状的最小二乘法分析表明,GHR基因外显子10不同基因型个体间3月龄体高差异显著(P＜0.05或P＜0.01),6月龄AA型个体体重显著高于AB型和BB型(P＜0.05),12月龄AA型个体体高和体重均显著或极显著高于AB型和BB型(P＜0.05或P＜0.01).初步推断藏羊GHR基因第10外显子基因座的A为优势等位基因,提示该位点可作为欧拉羊标记辅助选择的遗传标记之一.     

绵羊孕酮受体基因的PCR-SSCP分析

作者设计3对引物,采用PCR-SSCP方法检测孕酮受体（progesterone receptor,PGR）基因DNA结合区和配体结合区序列在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（多赛特和特克赛尔）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对绵羊繁殖力的影响;对小尾寒羊PGR基因外显子5、6和9克隆测序,结合GenBank提供的绵羊PGR基因部分编码序列,拼接出绵羊PGR基因DNA结合区和配体结合区的完整序列,推导出编码的氨基酸序列;并将人、兔、狗、绵羊、小鼠和大鼠的PGR基因这两个区域的核苷酸与氨基酸序列进行比较。结果表明,PGR基因DNA结合区和配体结合区序列在所检测的4个绵羊品种中都不存在单核苷酸多态性;人、兔、狗、绵羊、小鼠、大鼠PGR基因DNA结合区和配体结合区的核苷酸序列同源性分别为88.6%~97.2%和84.4%~96.3%,氨基酸序列同源性分别为97.6%~100%和96.3%~99.6%。可见,哺乳动物PGR基因DNA结合区和配体结合区序列保守性很强,这两个区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。     

7个牛品种PON2基因第9外显子SSCP分析及其外显子多态性扫描

对氧磷酶2（Paraoxonase-2,PON2）产物是脂肪代谢过程中的抗氧化酶,被确定为影响相关重大心血管疾病和人类寿命的重要候选基因。本研究利用直接测序法对PON2基因所有外显子进行多态位点扫描,利用PCR-SSCP技术对中国西门塔尔牛、鲁西牛、秦川牛、晋南牛、荷斯坦牛、摩拉水牛和尼里-拉菲水牛7个品种的478头个体PON2基因第9外显子T98C位点进行多态性分析。结果表明,PON2基因外显子上共发现4个单核苷酸突变位点,但均未引起氨基酸的改变;第9外显子扩增大小为167bp的片段存在单链构象多态性。除鲁西牛和荷斯坦牛外,其它5个品种牛在该基因座位都处于Hardy—Weinberg平衡状态（P〉0．05）。鲁西牛、南阳牛、晋南牛和荷斯坦牛4个群体处于中度多态（0．25〈PIC〈0．50）,其它3个牛种为低度多态。除摩拉水牛和尼里-拉菲水牛不存在AA基因型外,其它5个牛品种中均存在AA、AB、BB3种基因型,但优势等位基因在7个品种牛群体中存在差异,基因型频率在鲁西牛和南阳牛中AA〉AB〉BB;晋南牛则3种基因型频率之比约为1：1：1;中国西门塔尔牛则出现严重的偏态,B等位基因为绝对优势等位基因;2种水牛中,BB基因型为优势基因型,B等位基因为优势等位基因。利用SAS9．1软件GLM过程分析基因型均值,用邓肯法（Duncan’s）进行基因型间的多重比较,将该基因座不同基因型与7个牛品种间和鲁西牛6个年龄组（n=238）进行了差异分析,结果表明,不同基因型在品种间存在极显著的差异（P〈0．01）;鲁西牛各年龄组与各基因型间差异不显著（P〉0．05）,但各种基因型间存在有着极显著的差异（P〈0．01）。结合各种基因型个体在不同年龄组间的变化趋势,AA型个体可能具有相对较长的使用寿命。     

山羊FSHR基因第10外显子序列的克隆与比较研究

根据牛FSHR基因序列设计引物，以波尔山羊和莱芜黑山羊基因组为模板，应用PCR技术克隆测定了FSHR基因第10外显子序列，并与牛该区段序列进行了比较研究。结果表明，PCR扩增获得的片断为1643bp，三畜种FSHR基因第10外显子长均为1233bp。莱芜黑山羊和波尔山羊的第10外显子序列与牛该序列相比，同源性分别为97．49％和97．41％，分剐在31个和32个位点发生碱基突变。均引起10处氨基酸密码改变。波尔山羊该序列与莱芜黑山羊的比，同源性为99．60％，且3个位点有碱基突变，其中＋1184和＋1365住点突变引起氨基酸密码改变。     

山羊FSHR基因第10外显子序列的克隆与比较研究

根据牛FSHR基因序列设计引物,以波尔山羊和莱芜黑山羊基因组为模板,应用PCR技术克隆测定了FSHR基因第10外显子序列,并与牛该区段序列进行了比较研究。结果表明,PCR扩增获得的片断为1643bp,三畜种FSHR基因第10外显子长均为1233bp。莱芜黑山羊和波尔山羊的第10外显子序列与牛该序列相比,同源性分别为97.49%和97.41%,分别在31个和32个位点发生碱基突变。均引起10处氨基酸密码改变。波尔山羊该序列与莱芜黑山羊的比,同源性为99.60%,且3个位点有碱基突变,其中 1184和 1365位点突变引起氨基酸密码改变。     

绵羊催乳素受体基因外显子10的多态性分析

将催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)基因作为绵羊高繁殖力的候选基因,对其外显子10设计2对引物, 采用PCR SSCP 技术检测其在常年发情的湖羊及季节性发情的中国美利奴羊、罗米丽羊和罗米丽×中国美利奴（新疆军垦型）中的单核苷酸多态性。结果表明,引物P1、P2 的扩增片段均有多态性。与已知序列相比,P1扩增片段的AB型在第53 bp处出现A→G突变、在81 bp处出现G→A突变, BB型在该片段第53 bp处发生A→G的突变;对于P2扩增片段, CC、DD、CE和EF型均在第89 bp处发生C→T的突变,导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸(Pro→Leu),DD型还在146 bp处出现了C→G的突变,此突变导致氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸(Ala→Gly);CE型在该片段第132 bp处发生G→A的突变,未导致氨基酸的改变;EF型还在第132 bp处和第167 bp处分别发生了G→A、C→T突变,第167 bp处的突变导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸(Pro→Leu)。通过卡方独立性检验结果发现,4种绵羊在P1、P2引物扩增片段上各基因型的构成与品种间有极显著差异(P<0.01),说明PRLR基因对绵羊的繁殖性状有一定的影响。     

绵羊MSTN基因内含子2和外显子3部分序列的SNP检测和单倍型分析

本研究采用PCR和直接测序的方法对我国9个地方绵羊品种和1个引入品种共计60个个体进行了MSTN基因内含子2和外显子3的SNP检测和单倍型分析。结果表明:在已测序的60个个体中共发现15个SNPs(A1937C、T1942G、C1956T、A1972C、A1990G、A2008C、A2011G、C2019T、A2025C、A2027C、T2085G、T2173C、C2198T、C2210T和C2213T),它们全部存在于内含子2。同时检测到12种单倍型,其中单倍型Ⅰ(CGTCGCGTCCGCTTT)和单倍型Ⅷ(ATCAAAACAATTCCC)是2种主要的单倍型(频率分别为12.25%和77.80%)。单倍型Ⅷ广泛分布于10个受试绵羊品种中,而肉用型品种、肉脂兼用型品种和肉毛兼用型品种的所有个体均属此种单倍型且为纯合子,推测单倍型Ⅷ可能与绵羊的产肉性能有关。     

3个绵羊群体MSTN基因编码区PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了3个不同绵羊品种（杜泊绵羊、小尾寒羊、晋中绵羊）肌肉生长抑制素（MSTN）基因的单核苷酸多态性.根据3个绵羊品种MSTN基因Exon1（P1）、Exon2（P2和P3）和Exon3（P4和P5）序列设计5对PCR-SSCP引物并扩增,经SSCP分析,P1位点检测到A和B两个等位基因,AA、AB、BB三种基因型;且在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态,而在小尾寒羊和杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.P2和P5位点没有检测到多态位点.P3位点检测到A和B两个等位基因,AA、BB两种基因型;且在3个绵羊品种上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.P4位点检测到A、B和C三个等位基因,AA、AB、AC三种基因型;且在小尾寒羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态,在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg不平衡状态,在杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.     

小尾寒羊雌激素受体基因外显子4的克隆与序列分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR 技术扩增出小尾寒羊ESR基因外显子4的DNA片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy 质粒中,重组质粒用PCR 扩增进行阳性克隆鉴定,然后测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,同时将测定的小尾寒羊ESR基因外显子4序列与人、牛、猪、大鼠、鸡的外显子4序列进行比较。结果表明：克隆测序所得的核苷酸和翻译后的氨基酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比,同源性分别为77.68%～97.28%和71.82%～98.18%,显示了很强的保守性;小尾寒羊的核苷酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比存在1处特有变异,氨基酸序列23～36存在高变异区。     

不同绵羊品种FGF5基因的多态性分析

根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5（FGFS）基因的同源序列设计引物对绵羊基因组进行PCR扩增，将扩增片段进行克隆和测序，并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较，确定扩增的片段为绵羊的FGF5基因片段。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴等4个绵羊品种的多态性。结果表明：FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性。经克隆测序分析，位于外显子1的引物1扩增产物存在G→T突变，该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变；引物2扩增产物发生了碱基序列C→T的突变，这一突变位点没有引起编码氨基酸的改变，属于同义突变。对不同绵羊品种的基因型和基因频率统计结果表明，引物1扩增产物小尾寒羊、湖羊、藏羊以等位基因A为主，而中国美利奴羊则以等位基因B为主，且各群体均处于Hardy-Weinberg平衡；引物2扩增产物小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊均以等位基因E为主，而藏羊的基因型频率与其它品种有显著差异，中国美利奴羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态。