高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

在某集约化猪场采集疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病死猪的肺、淋巴结等病料,进行检测,将RT-PCR检测结果为阳性的病料处理后接种Marc-145细胞,培养72~96 h后细胞单层出现明显的CPE。收获病毒经RT-PCR方法检测,并将此PCR产物经纯化后连同引物送相关公司进行测序,结果显示,该病毒为繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因缺失株,将该病毒命名为HPPRRSV-GD07b株。将GD07b株序列与国内外19株PRRSVNsp2基因进行比较分析,结果表明,该毒株Nsp2基因与CH-1a株等4株PRRSV经典株同源性较低,为60.5%~81.6%;而与14株变异株同源性较高,为90.6%~98.9%。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株 Nsp10基因生物信息学分析

本研究旨在对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州JL株Nsp10基因(GenBank登录号:EU886322)进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步Nsp10的表达和ELISA检测方法的建立奠定基础。应用BioEdit、DNAStar、PsortⅡ、SignalP、TMHMM、ProtFun、Clustal_1.81、Mega等软件对Nsp10蛋白的理化参数、信号肽、跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、二级结构、亚细胞定位及与其他PRRSV毒株相应片段同源性等进行分析和预测。该蛋白理论分子质量为26.38 ku,pI为8.93,为稳定蛋白,不含信号肽,无跨膜结构,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明,该蛋白极有可能位于细胞质,其编码氨基酸序列与参考毒株同源性为97.4%~100%。该蛋白保守性较高,是可溶性蛋白,有良好的抗原性,具备作为靶蛋白建立免疫方法的条件。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp2基因并测序。应用DNAStar 7.0、ClustalX 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%。因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株的鉴定及部分Nsp2基因序列分析

本研究采集山西省不同地区的发病猪脏器组织与血液样品,采用特异性 RT-PCR方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)样品16份,应用设计的特异性引物扩增出Nsp2基因序列,利用DNAStar生物信息学分析软件,对获得的序列与国外代表毒株VR-2332、国内代表毒株CH-1a、BJ-4、HB-1及PRRSV变异毒株HuN4和JXA1的序列进行了比较,绘制系统发生树。氨基酸序列比较分析发现山西省流行毒株同源性分别在69.8%~71.7%、85.3%~87.9%、68.7%~70.6%、91.7%~94.3%、94.3%~98.5%、95.1%~98.9%。所获得的16株病毒之间的同源性在90.9%~100%之间。研究结果发现所获得的序列同源性与国内近几年流行的PRRSV的变异毒株HuN4和JXA1毒株的序列同源性最高,分别在94.3%~98.5%与95.1%~98.9%之间,Nsp2 基因缺失位置一致,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,即Nsp2基因分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,结果表明,山西省目前流行PRRSV的变异毒株与国内流行株属于同一分支。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2 基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基〖JP2〗因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒F株的分离鉴定

2012年2月,潍坊某猪场疑似发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。病猪主要表现为呼吸困难,耳朵发绀,皮肤有弥漫性出血点;剖检发现淋巴结、肺脏出血严重。从病死仔猪脾、肺、淋巴结和脑组织中分离得到病毒。将该毒株在Marc-145细胞上盲传3代出现典型细胞病变,F3代病毒滴度为106.5TCID50/mL。RT-PCR检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性。用F3代毒株进行动物回归试验,结果符合高致病性PRRSV致病特征。上述结果证明该猪场发生的传染病为高致病性PRRS,并且利用Marc-145细胞成功分离到高致病性PRRSV,命名为F株。本研究为高致病性PRRSV致病特点及其疫苗研制提供物质基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及遗传变异分析

2018年云南省边境地区某猪场猪群出现高热等症状,部分猪只死亡。为确认发病原因,采集死亡猪只肺脏组织样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) RT-PCR检测,然后将阳性样品接种Marc-145细胞,连续传代3次后发现产生稳定的细胞病变效应(CPE)。经间接免疫荧光试验(IFA)、毒价测定及病毒全基因组测序,最终确定病原为PRRSV,将其命名为YNML-2018株,毒价测定为10^-4.88 TCID₅₀/0.1 mL。全基因组序列分析显示,YNML-2018毒株基因组全长15 357 bp,包含8个开放阅读框(ORF),其中非结构蛋白2编码基因(NSP2)缺失90个碱基。病毒全基因组遗传进化分析显示,该毒株序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为95.3%～99.3%;其NSP2高变区序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为92.1%～97.8%;结构蛋白GP3、GP5氨基酸序列与国内分离的高致病性PRRSV毒株同源性分别为84.3%～99.6%和83.1%～99.0%。结果表明,YNML-2018株与近年来我国PRRSV流行株相比存...     

云南高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR技术对云南2007年采集的48份猪组织样品中病毒Nsp2基因进行检测,获得阳性样品14份,选择5份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比较及系统发育分析。结果发现云南病毒样品Nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为95．8％～99．0％和92．3％～98．6％。5份样品病毒Nsp2蛋白482位、534位～562位氨基酸均存在缺失,其中1份样品（YNMG）486位～489位氨基酸也发生了缺失。云南病毒样品在系统发育树上可划分为4个亚组群,分别与广东、广西、贵州、浙江、江苏、山东毒株遗传关系密切。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TM株的分离鉴定及其Nsp2序列分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异特点,本研究从广东省某猪场患有明显呼吸道症状的仔猪肺脏组织中分离到一株病毒,利用RT-PCR、基因序列分析,确定为美洲型PRRSV,命名为TM株。Nsp2基因序列分析发现,与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532位～560位共有30个氨基酸缺失;此外,与近年来国内分离的PRRSV变异株相比,在22位～42位有21个氨基酸的独有缺失。回归试验表明,该分离株可引起仔猪表现明显的临床症状和病毒血症,证实我国已经出现新缺失高致病性PRRSV毒株。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SHxx13/2013株的分离与鉴定

2013年初上海某猪场保育猪群中出现高热、呼吸障碍等临床表现,导致大部分发病猪死亡,为了确定此次猪群中爆发疫病的病原,本研究从发病猪群中随机采集了15份血液样品,利用RT-PCR方法对本次疫病病原进行了检测。结果显示,有11份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强阳性,且与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)对照大小相一致。随后从阳性样品中选取SHxx13/2013在Marc-145细胞中进行病毒的分离与鉴定,结果显示SHxx13/2013在细胞接种后第1代即出现明显的细胞效应(cytopathic effect,CPE),其病变特征与高致病性PRRSV强毒HuN4株一致。对SHxx13/2013第5代细胞分离毒进行RT-PCR和IFA等特异性鉴定,结果显示该毒株为PRRSV分离株,其蚀斑形态和生长特性与强毒HuN4株相似。分段克隆该毒株全长基因进行测序和序列分析,结果显示,新分离的流行毒SHxx13/2013株全长基因组为15 319 bp,其Nsp2基因特征与HP-PRRSV一致,在第482位和第534~562位发生两处共30个氨基酸的不连续缺失,且该毒株与高致病性PRRSV代表毒株HuN4亲缘关系较近,全长基因的核苷酸同源性为99.6%。本研究结果表明新分离的SHxx13/2013株属于高致病性PRRSV分离株,据此我们推测今年年初上海某猪场爆发的疫情主要是由HP-PRRSV感染所致。     

1株临床高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

本研究从江苏省某猪场患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪肺脏组织中分离到一株病毒,经病毒生物学特性测定、血清学试验、病毒基因鉴定,确定为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。人工猪体感染发病试验表明,该分离株可以引起商品仔猪出现明显临床症状和死亡,证实我国已经出现临床高致病性PRRSV毒株。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病性分析

为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为HP-PRRSV,将其分别命名为PRRSV CZ16A和NP16A。为研究PRRSV分离株CZ16A和NP16A对猪的致病性,将分离毒株经噬斑纯化后分别接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄健康仔猪,通过临床观察、解剖病理变化及病毒血症检测等指标初步探讨两株PRRSV的致病性。结果表明,分离株CZ16A和NP16A感染猪后均能够在动物体内复制,并引起体温升高,但两株PRRSV分离株均未引起试验动物的发病和死亡,剖检结果显示NP16A分离株能引起动物肺部实变、淋巴结肿大,其毒力比CZ16A分离株稍强。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5和Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR方法对2006-2007年华南地区部分省份的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得13个Nsp2基因的部分序列片段和14个ORF5基因片段。序列分析结果表明,所获得的13个Nsp2基因序列中均有2个区域存在明显缺失,核苷酸的同源性为96.9%～99.1%,与中国代表毒株CH-1a、美洲株代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别为85.1%～86.4%和67.2%～68.9%,与疫苗株MLV的同源性在67.6%～68.9%之间,而与欧洲株代表株LV的同源性在54.1%～55.9%之间;获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的相似性为同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%。与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%,86.6%～88.6%,85.6%～87.6%,54.7%～56.2%之间。结果表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型,进一步分析发现这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪运输流通等途径在全国范围流行扩散。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒湖北株的分离与鉴定

为了探明猪高热综合征的原发病原,对采自湖北省患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪组织病料进行病毒分离,结果分离到3株病毒。经电镜观察、免疫荧光试验、RT-PCR鉴定为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。病毒基因序列分析表明,其GP5及NSP2基因与高致病性PRRSV毒株有97%~99%的同源性。人工猪体感染发病试验表明,该分离株均可引起仔猪出现明显临床症状和死亡,证实湖北省已经出现临床高致病性PRRSV毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GD3株的分离鉴定及其分子特征

2005年从广东发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征疑似病料中,分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),命名为GD3株.采用RT-PCR、IFA对分离毒株进行鉴定,并在Marc-145细胞上完成了病毒的增殖和理化性质的鉴定.应用RT-PCR方法扩增出GD3株的6条基因大片段,扩增产物克隆于pMD18-T载体鉴定后测序,同时应用RACE技术对GD3株的5'末端进行扩增和测序.结果表明GD3株基因组全长15 425 nt,包含个9开放阅读框,5'UTR长189 nt,3'UTR长150 nt.序列分析结果表明,GD3株在分子遗传演化上介于PRRSV变异毒株(HUN4株、JXA1株)和CH-1a之间,与HuN4和JXA1之间的相似性为97.1%和97.2%;与CH-1a的核苷酸相似性为94.9%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株的致病性研究

为了解PRRSV安徽分离株的致病性,用从安徽省某发病猪场的病死仔猪组织中分离到的SCH07毒株接种40日龄健康仔猪,对其进行临床症状、病理剖检、病理组织学观察及抗体检测,结果表明：该毒株能引起仔猪高热、呼吸困难等明显临床症状和肺脏、淋巴结肿大、出血等剖检变化,病理组织学观察可见显著的间质性肺炎等病变,攻毒后第7天试验组仔猪血清中首次检测到抗体,并有一头在第15天死亡,证实安徽省已经出现临床高致病性PRRSV毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了 2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

为了对从湖南某发病猪场送检的血清中分离到的1株蓝耳病病毒进行鉴定,试验通过接种Marc-145细胞传代后产生明显而稳定的细胞病变,又经过RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)检测成功验证;通过对分离株的ORF5基因的测序结果表明,ORF5核苷酸序列与欧洲型代表株LV株及北美经典毒株VR-2332、国内经典美洲株CH-1a的相似性分别为64.5%、87.4%、93.0%,说明其属于美洲型;而将NSP2高变区的测序结果与JXA1等高致病性变异株的Nsp2比较后发现,都在同一位置不连续缺失30个氨基酸。说明成功分离到1株北美型变异株,最终将其命名为PRRSV CZ-HN株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及其ORF5基因遗传特性分析

用Marc145细胞从云南某猪场分离到两株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),将其命名为YN-1和YN-2。分离株在Marc145细胞上盲传4代后出现明显的细胞病变,其滴度为10^-3.6/0.1 mL。PCR方法对NSP2基因进行扩增结果表明,分离株缺失了90个核苷酸缺失,NSP2基因符合强毒特征。对分离株ORF5基因序列进行扩增和测序,进行同源性及遗传特性分析,结果表明,分离到的两株PRRSV位于进化树的同一个小分支上,其核苷酸同源性为99.5%,与山东株JN-HS、河南株Henan-1及越南株347-T-KSA位于同一个小分支上,其遗传距离较近,核苷酸同源性高达99.2%~99.8%,与国内经典毒株Ch-1a和VR-2332的核苷酸同源性仅为94.4%~94.5%,与国内其它强毒株的核苷酸同源性高达98%~99%,均属于强毒株。