猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵的卵母细胞发育及基因表达差异的研究

卵丘细胞是指包裹在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群,是一类与生殖细胞密切相关的体细胞。大量研究表明,卵丘细胞在卵母细胞的发育、成熟、排卵、受精以及受精卵发育过程中发挥了重要作用,卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用已成为关注的焦点。由于卵丘与卵母细胞之间的相互作用十分复杂,人们对参与这一细胞间互作的信号通路和反应过程相关基因的表达还缺乏深刻了解。本研究对比了有致密完整卵丘细胞包裹的卵母细胞和无卵丘细胞包裹裸卵的体外培养成熟过程中的成熟率、孤雌激活卵裂率、囊胚率的差异,并运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和半定量RT-PCR技术,比较了两者在基因表达上的差异,目的是进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理。材料与方法:采集大量猪的卵母细胞,捡出A级卵(胞质均匀且卵丘细胞层完整紧密,包裹五层以上的卵)和C级卵(有极少或无卵丘细胞包裹的卵)分别进行了体外培养、孤雌激活。同时对两类卵母细胞抽提RNA,进行DDRT-PCR,筛选出差异条带进行克隆测序,最后根据测序结果设计特异引物,最后通过半定量RT-PCR对筛选出的差异条带进行验证。结果与讨论:(1)在体外培养和成熟实验中,卵丘卵母细胞复合体(COC)中的卵母细胞的成熟率和卵裂率均显著高于裸卵的,而裸卵的囊胚率为0,表明卵丘细胞在卵母细胞的发育和成熟过程中起到了关键作用。(2)利用了3对锚定引物和随机引物,共发现了16条差异表达的片段,经过克隆测序最终得到了14条差异表达的序列,经过比对发现,其中3个片段分别与人的PELP1,Myo5b,calpastatin基因高度同源,另外5条序列与猪的EST同源,但功能未知,其余6条序列未找到同源片段。(3)经过半定量RT-PCR验证表明,大约有一半的条带在差异显示和半定量RT-PCR实验中的结果一致,其中PELP1,Myo5b基因在有卵丘细胞的卵母细胞中的表达量高于裸卵的,而calpastatin基因只在有卵丘细胞的卵母细胞中表达,在裸卵中则没有检测到。(4)相关研究表明,差异表达基因在雌激素受体的调节、细胞膜间的信息传导、细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用,这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。上述研究为进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理奠定基础。这些差异表达的基因也是卵母细胞成熟过程中的关键因子,可以作为筛选卵母细胞进行下一步操作的标记基因。     

利用差异显示法研究水稻耐淹涝相关基因

应用mRNA差异显示法对耐淹材料籼稻(Oryzasativassp.indica)FR13A和敏感籼稻(O.sativassp.indica)IR39595-503-2-1-2在淹涝胁迫下的基因差异表达进行了分析。结果显示,从40对引物中共扩增出1428条片段,筛选到102条在耐淹涝材料和敏感材料间差异明显的基因片段,差异率为7.1%。其中有42条差异带来自耐淹涝材料,有7个差异片段已通过Northern杂交验证在耐淹涝材料FR13A中表达。进一步克隆测序并进行数据库比对分析表明,有4个与水分胁迫产生的应答反应和生理生化变化有关,其中一个与ATP结合蛋白高度同源,另3个与异柠檬酸酶脱氢酶、NADH脱氢酶和乙醛酸转移酶部分序列高度同源,其余3个为新的cDNA片段。     

差异显示法分离水稻耐淹涝相关的基因

摘 要：应用mRNA差异显示技术(DDRT—PCR)对耐淹材料FR13A和敏感材料IR39595-503-2-1-2在淹涝胁迫下的基因差异表达进行分析。结果显示：从40对引物中共扩增出1428条片段，筛选到102条在耐淹涝材料和敏感材料间差异明显的基因片段，差异率为7.1% 。其中有42条差异片段来自耐淹涝材料，有7个差异片段已通过Northern杂交验证在耐淹涝材料FR13A中表达，进一步克隆测序并进行数据库比对分析表明：有4个与受到水分胁迫时产生的应答反应和生理生化变化有关，其中一个与ATP结合蛋白的高度同源，3个与异柠檬酸酶脱氢酶，NADH2脱氢酶和乙醛酸转移酶部分序列高度同源。其余3个为新的cDNA片段。     

家蚕bcl-2基因的克隆、序列分析及其表达模式

为了研究家蚕耐氟中毒分子机理,本文采用荧光差异显示技术分析了家蚕对氟化物耐性品系441和感性品系440添氟后的基因表达的差异,获得差异表达cDNA片段A14-6,数据库分析为编码抗凋亡基因bcl-2 (AB008449)。BmBCL-2编码965个氨基酸,分子量为108.800 kD,等电点为6.370。结构分析无C末端疏水跨膜结构,含有19个外显子和18个内含子,剪切信号符合GT/AG规则。蛋白质同源性分析表明BmBCL-2与BCL-2家族蛋白一样均有BH1、BH2、BH3和BH4功能域,用ClustalX1.83、MEGA3.1等软件分析氨基酸序列和得到系统进化树,结果表明BmBCL-2与其它物种BCL-2蛋白保守性较低。RT-PCR结果表明,bcl-2在家蚕耐氟品系441和感性品系440五龄第48h五个组织均有表达,在441DZ（耐氟品系）中表达丰度明显高于440DZ（敏感品系）,并且在脂肪体表达量相对较高。200mg•L-1氟化钠和清水对照处理家蚕后48h,bcl-2在41DZ和440DZ中肠的转录水平没有显著变化,但在添氟后,耐氟品系441F表达水平相对高于440F品系。以上结果暗示该基因可能与家蚕的耐氟性有关。     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因（Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD）。本研究利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5＇端非翻译区序列（5＇-UTR）、一个930bp的开放阅读框（ORF）和一个155bp的3＇端非翻译区序列（3＇-UTR）;基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

葡萄银染mRNA差异显示分析体系的建立及优化

mRNA差异显示(mRNA differential display)技术是筛选差异表达基因有效的方法之一（Peng and Agthui,1992)。本研究以中国葡萄属野生种的葡萄叶片为材料,采用改进的SDS／酚法(张今今等,2003)提取叶片总RNA,采用优化后的银染差显体系,比较葡萄白粉病病原菌诱导前后6个不同时期的样品,获得了数量适宜、差异显著和重复性好的差异表达cDNA片段。     

用DNA差异显示技术分离、测序和鉴定猪的两个新分子标记及其与性状的关联分析

为了寻找更多的和性状关联的猪候选基因或分子标记,用DNA差异显示技术扫描140头大白×梅山F2猪的DNA,发现了2个与猪的性状具有显著关联的分子标记,并对这2个分子标记进行测序和鉴定.标记1与最后肋骨处估测背膘厚(P＜0.01)、倒数三四肋骨处估测背膘厚(P＜0.01)、估测瘦肉率(P＜0.01)、骨重(P＜0.05)、骨率(P＜0.05)、肥肉重(P＜0.05)、肥肉率(P＜0.05)、瘦肥比率(P＜0.05)、肩部最厚处背膘厚(P＜0.05)、6～7胸椎间背膘厚(P＜0.01)等性状关联.标记2与背最长肌pH值(P＜0.05)、失水率(P＜0.05),系水力(P＜0.05),背最长肌肉色评分(P＜0.05),背最长肌含水量(P＜0.05)、肋骨数(P＜0.05)骨率(P＜0.05)、胸腰椎结合处背膘厚(P＜0.05)、胃净重(P＜0.01)等性状关联.经与GenBank进行Blast比较,这2个标记与已知的猪基因或基因组序列没有明显的同源性,提交到GenBank,登陆号分别为CN605659和AY626262.研究所用的方法为揭示新的猪候选基因或分子标记提供了一条新的途径.     

家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析

本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用.     

一个在超饲养朗德鹅肝脏中差异表达基因的分离和鉴定

为阐明鹅（Anser anser）肥肝形成的机制,使用mRNA差异显示技术研究超饲养和正常饲养条件下朗德鹅肝脏基因表达差异。基因转化生长因子β2(TGFB2)被证实在肥肝中上调（P < 0.01）,该基因1 248 bp的cds序列(GenBank 登陆号EF541127)与鸡TGFB2有94%的同源性。序列分析表明,该序列含有一个1 239 bp的开放读码框架（ORF）,编码412个氨基酸的蛋白质,该蛋白质序列存在2个保守的功能域：引导序列（TGFb前肽）和功能结构域（TGFβ）,并与其它同源蛋白有较高的同源性。应用生物信息学方法对该蛋白质的功能和结构进行了分析。组织表达分析表明,鹅TGFB2在肝、肌胃、脾和卵巢中表达丰富,在子宫、肺和肌肉中中等表达,在肾和腹脂中表达量较低。结果显示,超饲养诱导了鹅肝脏TGFB2基因mRNA表达水平的上调。     

家蚕卵黄蛋白组成及其胚胎时期的变化

家蚕(Bombyx mori)卵黄蛋白是家蚕胚胎发育的重要营养和能量来源。采用直接解剖蚕卵获取卵黄蛋白，结合蛋白质双向电泳和图像分析，对家蚕处女蛾卵及不同胚胎发育阶段蚕卵的卵黄蛋白质进行了研究，发现家蚕卵黄蛋白有203个蛋白质斑点；不同家蚕品种之间卵黄蛋白的组成存在一些差异；同一品种不同发育时期胚胎卵黄蛋白的组成基本保持不变。暗示了在胚胎发育过程中，胚胎不是选择性地吸收利用卵黄蛋白颗粒中的某种或某些蛋白质，而是以卵黄蛋白颗粒为单位，一个个地吸收利用。     

家蚕耐氟笥RAPD分子标记研究

在含有耐氟主效基因的家蚕品种T6和高敏感品种733新及其近等基因系NF733新中，采用200个RAPD随机引物进行扩增，获得了与家蚕耐氟性有关的两个分子标记OPD－08850和OPB－10917，用OPB－10917，分子标记在加交世代中进行检测，其结果是各回交世代耐氟性个体都出现同样的特异带，从而验证了分子标记的可靠性。     

低分子量热激蛋白Bmhsp19.9基因的表达

利用RT-PCR技术，对家蚕(Bombyx moil)低分子量热激蛋白Bmhsp19．9基因进行了定量表达分析。Bmhsp19．9在各组织中均有一定量的表达，但不同组织间的表达差异达10多倍，表达量丰富的组织是生长发育旺盛的组织，如精巢和卵巢，然后是丝腺、蛹等组织。其应激表达模式可分为3类，以其在精巢、后部丝腺和脂肪体中的强应激表达模式为主，经热刺激处理后其表达量有显著增加。经刺激诱导2h后其表达量达到最高，随后逐渐降低，在热刺激诱导12h后是未刺激的2～3倍，而此时Bmhsp19．9在脂肪体中的应激表达是其对照的10多倍。根据Bmhsp19．9在不同组织中的基本表达量、应激表达量和应激表达的持续时间各不相同，显示其与细胞分裂与分化等生命活动有一定联系。并认为其在后部丝腺、脂肪体、精巢、卵巢与血液中作用方式不一样，推测其作为分子伴侣在组织间的作用对象与作用效应也应有所差异。     

家蚕幼虫的造血器官对重离子射线12C5+的感受性

为了研究造血器官对重离子射线的感受性，研究了碳离子射线(^12C^5 )局部照射家蚕(Bombyx mori)幼虫的造血器官后血液中的血球密度的变化。结果表明30Gy照射对造血器官的造血机能没有明显的影响，50Gy照射能引起造血器官的机能低下，50～300Gy之间没有明显的剂量依存关系；不同发育阶段幼虫的造血器官表现为随着个体的发育对重离子射线的感受性降低，雌雄间没有明显的性别差异。没有观察到由于单侧造血器官的机能障碍而引起残存在体内的另一侧造血器官的机能增强的所谓补赏生长现象。     

家蚕肠道产蛋白酶菌株的分离与鉴定及其发酵条件

为探明家蚕肠道中产蛋白酶细菌的种类分布及其作用效果,本研究以家蚕(Bombyx mori)4龄幼虫肠道内容物为材料,采用牛肉膏蛋白胨培养基和酪蛋白培养基分离筛选产蛋白酶细菌菌株,利用16SrDNA序列分析鉴定其种属,并研究其产酶能力和产酶活力较高菌株的最适发酵条件。结果获得3株产蛋白酶菌株皓月NA1、951NA3和951NA6,均归属于不动杆菌属(Acinetobacter),其中皓月NA1号细菌产酶能力最强,最佳产酶量为29.5U/mL。以玉米粉10000mg/L、黄豆粉10000mg/L、MgSO4400mg/L、NaC115000mg/L和K2HPO41000mg/L作为发酵培养基成分,在35℃、起始pH9.0、装液量为80mL/150mL、180r/min振荡培养48h的优化发酵条件下,皓月NA1号细菌最大产酶量可达50U/m L。研究结果对家蚕肠道微生物的分布及肠道益生菌的作用效果调控有着十分重要的意义。     

壬基酚对家蚕（Bombyx mori）生长发育的影响

采用添加环境激素壬基酚（Nonylphenol,NP）人工饲料饲养家蚕（Bombyx mori）的验方法,观察了家蚕的生长速度、生长量、变态、生命力情况。结果表明,连续取食0．500mmol·L^-1以上浓度壬基酚的饲料,家蚕幼虫和蛹的生长速度、生长量、发育整齐度、生命力等都明显下降,在发育后期和蜕皮、化蛹、羽化等变态时期更加明显。同时,NP在蚕体内可能有累积作用。2．000mmol·L^-1浓度的NP能使家蚕幼虫很快死亡。NP对家蚕生长发育的影响有明显的性别差异,导致家蚕的雌雄大小开差缩小,并且具有显著的浓度效应和时间效应,是环境激素效应的典型表现。     

家蚕杆状病毒bro-d基因缺失对病毒基因转录和细胞凋亡的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bro (baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列.为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除BmNPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕BmN细胞,利用qRT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响.结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P＜0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p1O的转录水平也都显著下降(P＜0.05);iap2的转录水平显著下调(P＜0.05).在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P＜0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P＜0.05),进而导致细胞凋亡水平上升.结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平.研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路.     

家蚕AFLP分子连锁图谱的构建及其分析

以F2代91个个体作为作图群体，为家蚕（Bombyx mori）茧质性状的QTLs定位构建了一张较高密度的AFLP家蚕分子连锁图谱。692个有效位点中的550个构成了a和b亚群，其中a亚群21个连锁群含233个标记，b亚群为28个连锁群含317个标记。a、b亚群中各连锁群上标记数目变化范围在4～43和3～35个，连锁群总长度为1868．10和2677．50cM，连锁群的长度变化在22．3～424．3和2．4～366．5cM，标记的平均图距变化在3．39～17．43和0．80～26．96cM，位点间的平均距离为8．81和9．26cM。平均图距小于10cM的连锁群有14和18个，大于10cM小于20cM的连锁群有7个。连锁群上位点平均数为11．1和11．31个，连锁群的平均长度为89．0和95．6cM。a、b亚群平均总长为2272．8cM，平均图距9．06cM。符合QTLs定位的基本要求。