牛nanog基原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛(Bos taurus)原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEx-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanog基因编码序列.重组质粒转化大肠杆菌JM109(Escherichia coli),在不同的培养温度(25、30和37℃)和不同浓度的IPTG(0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol/L)诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白.     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

牛Nanog 原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。     

小鼠抗病毒基因viperin的原核表达及其抗原性探索

Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,在进化上高度保守。本研究以小鼠脑组织为原材料,通过RT-PCR扩增得到包括完整open reading frame（ORF）的1 155 bp的viperin基因序列,成功亚克隆并构建了原核表达载体pET-32a-vip,将其转化到大肠杆菌Rosetta中进行原核表达。结果表明：原核表达的重组蛋白viperin主要以包涵体的形式表达,用镍离子亲和层析法获得纯度较高的viperin蛋白,为探讨原核表达的viperin抗原特性,将纯化的viperin蛋白免疫4周龄昆明小鼠,制备得到抗viperin多克隆抗体。经Western blot和IFA检测,该抗体能与真核细胞自然表达的viperin反应,特异性良好且效价高,表明原核表达的viperin具有良好的抗原性。获得的多克隆抗体为进一步研究viperin的抗病毒生物学功能奠定了良好的基础。     

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

牛干扰素-tau基因的原核表达及生物功能鉴定

本试验采用PCR方法直接从牛早期胚胎细胞液中扩增牛干扰素-tau （bIFN-τ）基因（含信号肽基因序列）,并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆,将含信号肽和不含信号肽的bIFN-τ 片断分别克隆到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,进行IPTG诱导表达,表达产物进行变性、复性和纯化,最后通过抗病毒活性检测和对体外培养的牛子宫内膜上皮细胞形态变化的影响,鉴定其生物学功能。结果表明,不提取胚胎基因组DNA,以胚胎的裂解液为模板,可以从少量（5枚）牛囊胚中直接扩增得到bIFN-τ基因,与Genbank报道的序列相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别达99％和97％;SDS-PAGE电泳检测,不含信号肽的bIFN-τ基因与表达载体形成的重组质粒,在约20kD处出现特异性条带,与目标蛋白分子量一致;病毒抑制法测定rbIFN-τ的抗病毒活性单位为1×104IU/mg,在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加rbIFN-τ作用24 h后,细胞体积增大,细胞内出现明显的囊泡状结构,表明本研究获得的rbIFN-τ具有一定的生物活性。     

高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

手掌参中赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因的表达、纯化及鉴定

目的: 构建含赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因(gcgasa)的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：手掌参。方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物,分别对gcgasa基因编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增,将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒。经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并采用SDS-PAGE、Western-blotting、电镜超薄切片技术检测外源蛋白的表达及定位情况。对于水溶性蛋白,采用Ni2+-NTA亲和层析及凝胶过滤手段纯化。结果: 含有信号肽的外源基因在大肠杆菌周质空间中以包含体形式存在,而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白。结论：首次在原核表达系统中高效表达了水溶性的gcgasa蛋白,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

花生抗黄曲霉相关ARAhPR10基因克隆及其原核表达

花生黄曲霉污染已成为制约我国花生及花生制品出口贸易的关键因素。基于花生抗黄曲霉相关EST序列,RT-PCR法克隆花生ARAhPR10基因（gb｜EU661964.1）,开放读码框471bp,编码157个氨基酸,分子量16.9kD,等电点5.03。与已报导AhPR10（gb｜AY726607）相似性为49.3％。推导氨基酸序列含有PR10家族的高度保守“P-loop”基序（G＊GG＊G）和Betv1保守疏水结构域“GVALP PTAEK ITFET KLVEG PNGGS IGKLT LKY”,推测ARAhPR10是该花生PR10家族的新成员。其基因组扩增序列长度561bp,两个外显子间存在一个长度为87bp的内含子。原核表达ARAhPR10的融合蛋白约25kD,Ni^＋-NTA树脂亲和纯化后获得电泳单一条带。纯化的ARAhPR10融合蛋白具有体外核酸酶活性,预测其具有抗黄曲霉活性。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为ARAhPR10功能研究奠定了基础。     

埃及伊蚊免疫应答相关基因mapk-like的dsRNA原核表达及其饲喂后表达水平的变化

mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因,与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序,其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的dsRNA,本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli) HT115高效和廉价的优点,根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列,设计特异性引物,PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like (GenBank登录号：AAEL003728-RA),将其连接到克隆载体pMD18-T上,利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体pLitmus28i的2个T7启动子之间,成功构建可诱导形成目的双链RNA (dsRNA)的原核表达重组载体pLitmus28i-mapk-like,并转化大肠杆菌HT115,经IPTG诱导,1 mL菌液的dsRNA产量可达1.18μg,电泳检测条带清晰,质量良好。此外,利用壳聚糖包裹dsRNA形成纳米微粒,上清经电泳检测表明,壳聚糖的聚沉效率良好,纳米微球可有效防止dsRNA从饲料琼脂块中游离出来,提高dsRNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的dsRNA后,相对转录表达水平为65.55%,表达量明显下调,饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因,为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。     

杜氏盐藻磷脂酶C基因DsPLC的原核表达与纯化

为了进一步研究磷脂酶C的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了Ds PLC的开放阅读框序列,并与质粒p GS21a连接,构建了原核表达载体p GS21a-Ds PLC。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达出融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在包涵体和上清中均存在。可溶性蛋白经His柱纯化后进行电泳分析,结果表明,在96k Da左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在96kDa左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白是带有His标签的磷脂酶C。盐藻磷脂酶C的成功表达与纯化,为深入探讨磷脂酶C的性质及功能奠定了基础。     

拟南芥质膜水通道蛋白RD28保守区段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备

实验利用ＰＣＲ技术,从拟南芥原膜水旧白ＲＤ２８的ｃＤＮＡ中扩增了所有植物细胞质膜水通道蛋白保守区段（４２０ｂｐ）,并将其构入ｐＧＥＸ－ＫＧ。酶切、测序分析表明重组质粒ｐＧＥＸ－ＲＤ２８结构正确。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ可诱导表达分子量约４０ｋＤ融合蛋白ＧＳＴ－ＲＤ２８,该蛋白主要以非包涵体的形式存在。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱纯化得到了高纯度Ｇ     

重组K88黏附素亚单位蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

采用响应面分析方法,对肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli)K88黏附素亚单位重组蛋白FaeG诱导表达的主要影响因素进行了优化研究。响应面分析结果表明:不同的诱导时机、IPTG浓度及诱导时间对目的蛋白表达量均有显著影响(P<0.01),三因素之间的交互作用对目的蛋白表达量也有极显著的影响(P<0.01)。通过进一步的模拟优化,得到了最佳诱导表达条件为培养BL21(K88ac)重组菌株2.5h后,加入IPTG至终浓度0.8mmol/L,37℃诱导培养5h。采用以上参数进行验证实验,得到目的蛋白在全菌蛋白中的表达含量为35.4%;与单次单因子法得到的最佳表达条件下的表达量(27.5%)相比,提高了28.7%。采用响应面分析法可以确定IPTG的诱导时机、诱导浓度及诱导时间等多个因素对重组蛋白在大肠杆菌中表达的最佳作用条件,有利于提高目的蛋白的表达量。     

十字花科黑腐病菌hrpG基因原核表达

在十字花科黑腐病菌（Xcc）中,hrp基因对寄主的致病性和非寄主的超敏反应中起核心作用,而hrpG对整个hrp基因簇起调控作用。HrpG为OmpR家族的双组分系统感受调控蛋白,含有两个结构域,分别是N端Response_reg和C端Trans reg_C。本研究利用表达载体pQE-30Xa,成功构建了HrpG的表达重组子,在E.coliM15[pREP4]中进行诱导表达。通过调节诱导温度、IPTG浓度和诱导时间最终确定在温度为20℃,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。hrpG基因在宿主细胞E.coli M15获得高效可溶性表达。目前尚未有可溶性HrpG蛋白获得成功表达的报导,本研究中获得HrpG蛋白在大肠杆菌获得大量可溶性的表达,将为in vitro研究HrpG的生理活性,特异的结合位点和调控功能研究打下良好基础。     

大豆发状根乙醇诱导表达系统的建立及验证

为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GUS的表达情况和GUS酶活性高低评定该系统在大豆发状根中的诱导效率,并通过检测GmFT2a表达水平加以验证。结果表明,在非诱导条件下,ALCA-mini35S-GUS发状根中未见GUS表达,而在培养基中添加乙醇后组织化学染色效果明显,说明GUS基因表达。乙醇诱导表达的效率与乙醇浓度有关,当乙醇浓度为0.05%、处理60 h时GUS相对表达量达到最高值,处理72 h时GUS酶活性最高;0.05%乙醇处理72 h时,ALCA-mini35S-GmFT2a发状根中GmFT2a相对表达量平均值约为诱导前的150倍,个别样本可达初始值的400倍。综上所述,乙醇诱导表达系统可以在大豆发状根中发挥作用,该系统不仅可用于大豆基因功能研究,而且可为培育外源基因表达可控的转基因大豆品种提供新的技术手段。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

Overlap PCR克隆黄牛脂肪特异性磷脂酶A2基因(AdPLA)及其原核表达

脂肪特异性磷脂酶A2基因(adipose-specific phospholipase A2,A dPLA)在脂肪组织甘油三酯水解过程中发挥着重要的调节作用,为了构建黄牛AdPLA基因原核表达系统,本研究通过Overlap PCR方法从黄牛(Bos taurus)基因组DNA中得到了AdPLA基因编码区全长,将其克隆到pGM-T载体上,阳性克隆经测序表明,与NCBI公布的序列(GenBank No.NM_001075280)完全一致.阳性质粒经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后,将其定向重组到pET28a(+)原核表达载体上,转化感受态大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中,用IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白His-AdPLA在大肠杆菌中表达,证明成功构建了AdPLA基因原核表达系统,为进一步研究黄牛AdPLA基因的功能和AdPLA蛋白产品开发提供了依据.