拟南芥蛋白激酶SnRK1.1的激酶活性分析

本研究分别纯化了细菌内的蛋白激酶SnRK1.1融合蛋白和拟南芥中的蛋白激酶SnRK1.1蛋白,使用合成的SP11多肽片段作为底物,通过体外激酶试验结合放射性同位素γ32P检测了SnRK1.1蛋白对底物SP11的磷酸化活性。与GST蛋白相比,GST-SnRK1.1融合蛋白能够显著磷酸化底物SP11多肽片段;与野生型Col-0纯化产物相比,从转基因拟南芥中免疫沉淀得到的GFP-SnRK1.1蛋白也能够显著磷酸化底物SP11多肽片段。最终,本研究成功建立了蛋白激酶SnRK1.1的体外磷酸化检测体系,为深入研究SnRK1.1的功能及其SnRKs家族成员参与调控的信号通路奠定了基础。     

利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和Westem-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。     

SnRK蛋白激酶家族及其成员SnRK2的功能

蔗糖非酵解型蛋白激酶(sucrose non-fermenting1-related protein kinase,SnRK)是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr类蛋白激酶,参与植物体内多种信号途径的转导,在植物的抗逆境生理过程中扮演了重要角色。本文介绍了植物SnRK家族,重点阐述了SnRK2的结构、相互作用蛋白及该激酶活性的调节。SnRK2可以被NaCl及ABA等渗透胁迫激活,调节一系列相关基因的表达,从而提高植物对逆境的抵抗能力。     

茶树CsbZIP4转录因子正调控拟南芥对盐胁迫响应

bZIP转录因子是真核生物中一类多功能蛋白家族,参与种子成熟、光信号调节、胁迫响应等多种生物学过程,拟南芥中根据序列相似性和保守域主要分为10个亚家族(A-I和S)。本文以茶树的C亚家族转录因子CsbZIP4为研究对象,调查非生物胁迫下的表达模式,及转化拟南芥后CsbZIP4过表达对耐盐性的影响。结果显示,在4℃低温、外源ABA、盐和干旱胁迫处理后,CsbZIP4的表达在茶树叶片中呈上调模式,特别是在盐和干旱胁迫下其表达分别上调2.9倍和2.2倍;而在根中,低温、盐和干旱胁迫均能显著抑制CsbZIP4的表达,其中盐胁迫能将其表达抑制2倍;荧光显微镜下观察CsbZIP4-GFP融合蛋白,将CsbZIP4定位于细胞核中;CsbZIP4的过表达能够降低转基因株系种子萌发时对外源ABA、盐胁迫的敏感性,在300mmolL~(-1)NaCl盐胁迫下,转化拟南芥植株过表达CsbZIP4增强抗性,其叶片的SPAD值较高,同时过表达株系中盐胁迫响应基因AtSOS1的表达显著增强。根据CsbZIP4正调控拟南芥的盐胁迫响应,推断CsbZIP4与茶树抵御盐胁迫密切相关。     

高山杜鹃转录组测序及MYB转录因子家族分析

MYB转录因子是植物中最大的一类转录因子家族,参与调控植物的生长发育、次生代谢、逆境胁迫等生物学过程.目前,关于高山杜鹃MYB转录因子的研究尚未见报道.本研究利用SMRT高通量测序技术对高山杜鹃品种'富丽金陵'进行转录组测序,得到了15.37 Gb数据,通过去冗余获得75002条转录本序列.其中,71155、33653、30359条转录本分别在NR、GO、COG数据库中具有匹配信息.基于高山杜鹃转录组数据,鉴定了64个转录因子家族,其中MYB基因有220个.根据结构特性将MYB基因分为4类:1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB,其氨基酸序列包含20种保守元件.进化树分析结果显示,高山杜鹃MYB基因分为28个亚组.研究采用单分子实时测序技术(single molecule real time,SMRT)对高山杜鹃品种'富丽金陵'转录组进行测序,将获得的转录本序列进行功能注释和分类,对获得的220个MYB基因进行生物信息学进行分析,相关结果具有一定参考意义.     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子Atlg30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因Atlg30210的全长读码框。多序列比对结果表明，在推导的氨基酸水平上，该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域，与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT—PCR实验结果表明，该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高，具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。     

木薯蛋白激酶MeSnRK2.12与转录因子MebHLH1的互作鉴定及其表达分析

蛋白激酶SnRK2s (Sucrose Non-fermenting Related Protein Kinase 2)是植物抗逆境机制中的关键组分。木薯是全球重要的食品和工业作物,具有高淀粉累积和耐逆境的特点。迄今对木薯MeSnRK2家族成员参与逆境下淀粉合成调控的内在机制尚不清楚。本文围绕SnRK2家族受ABA微弱诱导的成员MeSnRK2.12展开研究,先对其进行生物信息学分析后发现其启动子区分布逆境响应元件:干旱胁迫MBS和ABA应答ABRE等顺式作用元件,且其氨基酸序列与AtSnRK2.8和OsSAPK1/2高度同源。ABA和PEG6000处理木薯SC8植株后发现, MeSnRK2.12可以在2 h内快速响应ABA和PEG6000处理,其转录活性在根中被抑制;在茎中被诱导上调,最高值分别为对照的15.0倍和8.0倍;在叶中也呈现上调趋势,但程度低于茎中。亚细胞定位试验结果显示MeSnRK2.12分布于细胞质和细胞核,利用酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)试验均验证了MeSnRK2.12和转录因子MebHLH1间存在互作,且前期研究发现MebHLH1可以上调木薯蔗糖合酶基因M...     

辣椒TALE转录因子的生物信息学分析

TALE转录因子家族广泛存在于植物中,在植物生长发育的各个阶段发挥重要作用,但是目前关于辣椒TALE转录因子家族的研究鲜见报道。本研究借助于生物信息学手段,通过HMMER、SMART、MEGA5.05、GSDS、MEME、DNAMAN、SOPMA、SWISS-MODEL等软件和网站对辣椒TALE转录因子类型、结构域、系谱进化、蛋白理化性质及高级结构、信号肽进行分析。分析显示20个辣椒TALE转录因子家族成员均含有HOX主结构域;系统进化树分析显示,20个TALE转录因子家族成员可分为KNOX和BEL两个亚族,同一亚族含有相同的保守基序以及相似的基因结构和蛋白跨膜结构;辣椒TALE转录因子家族的内含子在3~6之间;α-螺旋和无规则卷曲是该家族基因主要的二级结构,三级结构中都含有螺旋-转角-螺旋结构。本研究分析了辣椒TALE转录因子的生物信息学的特征,结果表明该基因家族在辣椒中具有稳定、保守的特点,这为今后研究该基因参与的生长发育过程及其作用奠定了一定的理论基础。     

辣椒GATA转录因子的生物信息学分析

本研究旨在分析和鉴定辣椒GATA转录因子的家族成员的生物信息学特征,为今后进一步的实验研究奠定基础。利用生物信息学手段,通过HMMER和SMART软件对辣椒GATA转录因子进行鉴定。利用Clustal X 1.83、MEGA5.05、GSDS、MEME等软件对辣椒GATA转录因子进行生物信息学分析。本研究鉴定出24个辣椒GATA转录因子家族成员。系统进化树的结果显示,24个GATA家族成员分为4个亚族。GSDS软件结果表明辣椒GATA转录因子的内含子、外显子分布情况。DNAMAN软件和MEME软件结果显示辣椒的大部分GATA转录因子是保守的。染色体定位软件Map Inspect分析表明,辣椒GATA转录因子在辣椒12条染色体上分布并不均匀。本研究鉴定并分析了辣椒GATA转录因子的生物信息学的特征,为以后继续研究其功能提供了一定的理论基础与现实意义。     

拟南芥bZIP基因家族系统发育树比较分析

bZIP蛋白是植物中特有的一类转录因子,包含亮氨酸拉链结构域和碱性结构域两部分。在种子贮藏基因表达、光形态发生及器官建成以及植物对ABA、光、厌氧生活和发育信号的反应中,bZIP蛋白家族对调节基因的表达都起到重要的作用。对已鉴定出的78个拟南芥bZIP基因(包括-like)中72个bZIP基因(不包括-like和假设蛋白),利用系统发育树分为8个组,以期进一步探讨进化组中的生物特征和功能。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

小麦突变体AS208中Glu-B1位点缺失对籽粒中蛋白体形成和储藏蛋白合成与加工相关基因表达的影响

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦籽粒贮藏蛋白的重要成分,其组成、表达和含量决定面团弹性和加工品质。本研究以Glu-B1位点上1Bx20和1By20双亚基沉默的小麦无性系变异体AS208为材料,以AS208的来源亲本轮选987作为对照,对AS208中Glu-B1位点的沉默机制和1Bx20、1By20亚基沉默对种子中蛋白体融合以及合成加工相关基因表达的影响进行了研究。Southern blot分析发现AS208比轮选987少2条特异带,染色体原位杂交(FISH)结果显示轮选987中有6条染色体出现杂交信号,而在AS208中有4条染色体出现杂交信号,表明AS208基因组中缺失Glu-B1位点。透射电镜观察发现,与轮选987相比,AS208的籽粒蛋白体形成过程,以及蛋白体大小和形状基本一致。qRT-PCR检测发现,在12个与籽粒蛋白质合成与加工相关基因中,有7个的表达模式两品种相似,有8个的表达量在AS208中高于在轮选987中,特别是Bip、PDI-1和PDI-5基因(高1.5~2.0倍)。本研究结果表明,小麦Glu-B1位点的基因对种子中蛋白体的形成没有明显影响,但一定程度上刺激了多数蛋白质合成和加工相关基因的表达,保证了种子内蛋白含量、蛋白体外形和大小基本不变,表现负反馈调节效应。     

拟南芥H~+_-焦磷酸化酶AVP1互作小GTP结合蛋白AtRAB的特性鉴定与功能分析

以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。