鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV） C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

猪瘟重组蛋白E2的兔体免疫保护试验

鉴于猪瘟病毒不能使家兔发病,但能使之产生免疫原性,而且猪瘟兔化弱度苗能在兔体的定型热反应.本研究选用家兔为试验模型,将自制的亚单位疫苗用弗氏佐剂乳化后免疫家兔,持续一定的免疫周期后,用猪瘟活疫苗(Ⅱ)攻击免疫及对照试验家兔.根据T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA及攻毒保护试验对所制备的抗原进行了全面的评价.结果表明,该免疫原具有良好的免疫原性,而且能保护免疫家兔为4/4.可以进行下一步的开发和利用价值.以期该疫苗能为猪瘟的防治做出贡献.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验初报

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白亲和肽的原核表达及其病毒亲和性分析

为了研究猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白(M蛋白)亲和肽的病毒亲和性,建立快速有效的TGEV检测方法,设计了1条含有TGEV M蛋白亲和肽的串联基因,核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工基因合成获得了含有M蛋白亲和肽基因的重组质粒pUC57-MQHT。然后,根据合成基因的序列,设计合成了1条特异性引物,以pUC57-MQHT为模板,通过PCR获得了150 bp的TGEV M蛋白亲和肽基因。亲和肽基因通过BamHⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1,获得重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。重组质粒经BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT,分子质量分别为25,31 ku。切胶纯化后,重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT分别经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。Western Blot分析表明,2种重组蛋白可与TGEV特异性结合。Dot-ELISA分析表明,在TGEV滴度为1×10~3,5×10~2,2.5×10~2 TCID50/mL时2种重组蛋白都可显示出阳性反应,而在1.25×10~2 TCID50/mL滴度时无可见斑点,具有良好的TGEV亲和性。阻断试验表明,1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株(1×10~5 TCID50/mL)与2种重组蛋白的结合,特异性良好。为建立TGEV诊断方法奠定了一定的理论和物质基础。     

禽用疫苗病毒浓缩技术的研究

采用FILTRON中型盒式超滤系统,分别选用截留分子量为30,50,100及300 K 4种不同孔径的超滤膜,对NDV,AIV,EDS76V,IBV及IBDV共5种病毒抗原液进行了浓缩试验研究。结果显示,这4种孔径的超滤膜均可用于上述5种病毒液的浓缩,其病毒的截留率可达99.9%~100%;采用各种病毒浓缩液、未浓缩病毒液及超滤液制成各种相应浓缩苗、未浓缩苗及超滤液乳剂免疫试验鸡。试验证明,浓缩苗明显优于未浓缩苗,在病毒浓缩过程中均未出现有效抗原成分的丢失,其抗原性也未发生变化。     

犬瘟热病毒疫苗免疫逃逸株的血凝素基因变异研究

为了弄清是否有新基因型犬瘟热病毒出现,对山东省不同地区的免疫水貂、狐狸和犬进行了犬瘟热病毒检测,扩增了病毒核衣壳基因和血凝素基因(H),并对13个犬瘟热病毒山东株(8株貂源,2株狐狸源,3株犬源)血凝素基因进行了测序。结果表明,13个犬瘟热病毒山东株之间H基因核苷酸同源性为99.1%~100.0%,均为Asia-1型,这也是我国目前水貂犬瘟热病毒唯一的基因型。与2012年之前的犬瘟热病毒中国分离株及疫苗株相比,13个毒株H基因有4个氨基酸的一致性变异,即P200S、M263I、I542N和Y549H,N-糖基化位点比Onderstepoort株多6或7个,比CDV3株多3或4个。抗原性分析表明,与疫苗株相比,13株山东株在540-549位氨基酸出现一个新的抗原区域,210-230,327-347位的抗原区域也与疫苗株不同,这些变异可能是我国貂狐犬瘟热免疫失败的原因。     

如何确保球虫疫苗免疫成功

球虫病是危害养鸡业的主要疾病之一,特别是地面平养和两高一低鸡舍中发病较严重,不仅可以引起鸡群的大量死亡,而且会造成饲料转化率低、增重降低,还可继发其他细菌性和病毒性疾病,造成巨大的经济损失。防治球虫病有药物预防和生物防治两种方法。在药物预防方面,总结出了早期投药、轮换用药、穿梭用药、连续用药、渐减用药、联合用药等多种给药方法,虽然控制了局部地区某一时间段鸡场的病情发展,但整体上球虫病仍顽固地威胁着     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因免疫小鼠诱导抗体的研究

将犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid protein, N)的N蛋白基因克隆到pMD-18T载体,经酶切分析测序获得阳性重组质粒。采用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA中,电泳测序筛选阳性克隆pcDNA-N,转染COS-7细胞,IFA验证结果显示转染的COS-7细胞胞浆中表达了CDV的N蛋白。与弗氏佐剂乳化完全后将重组质粒pcDNA-N腹腔注射8周龄BABL/c小鼠,同时设pcDNA原载体做阴性对照,2周为间隔共免疫3次,三免两周后采血,ELISA检测效价。结果显示：pcDNA-N试验组抗体滴度为101.62±0.164,对照组为100.52±0.56。表明犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因免疫小鼠可诱导机体产生特异性体液免疫。     

响应面法优化菜籽蛋白酶解条件

采用碱性蛋白酶水解菜籽蛋白,制备具有生物学功能特性的活性肽。选取pH值、温度和底物质量分数3个因素进行中心组合试验设计,利用响应面法对菜籽蛋白酶解条件进行优化研究。通过minitab15软件对水解度的分析表明,在酶解pH值9.5,温度50℃,底物质量分数为4%时,酶解产物水解度最高。该结果与实测值相符。     

响应面法优化牛乳蛋白的水解工艺研究

为降低牛乳蛋白中的致敏蛋白含量,制备婴儿配方乳。利用蛋白酶水解牛乳蛋白,在筛选出最佳酶解用酶的基础上,以胰蛋白酶浓度、酶解时间、酶解温度为影响因子,在单因素试验结果的基础上,应用Centure-Composite Design中心组合方法进行三因素三水平的实验设计,以牛乳蛋白水解度为响应值,运用响应面法对水解条件进行进一步优化。结果表明：酶浓度、酶解时间对牛乳蛋白水解度影响显著;牛乳蛋白质水解的最佳工艺为：以胰蛋白酶为水解用酶,水解温度为54.65℃,酶添加量为0.79%,酶解时间为47.01 min。回归方程预测牛乳蛋白水解度理论值可达到20.78%,3次验证实验的平均水解度20.74%,与预测值相对误差为0.2%。说明利用响应面实验设计研究出胰蛋白酶水解牛乳蛋白最佳工艺,为婴儿配方乳的生产奠定了基础。     

响应曲面法优化盐溶法提取花生粕蛋白工艺

以花生粕为原材料,研究氯化钠浓度、pH值、料液比、浸提时间和浸提温度对花生水溶性蛋白的提取率影响,在单因素试验的基础上采用响应面法,研究盐辅助法提取花生粕蛋白的最优提取工艺参数。结果表明,在料液比为1∶19,Na Cl浓度为0.17 mol/L,浸提温度为58℃,浸提时间为42 min,pH值为9.86时,花生粕蛋白提取率最高,为39.33%。     

葡萄A病毒外壳蛋白基因克隆及分子变异分析

为获得葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)外壳蛋白(CP)基因,并为开展GVA-CP介导的抗病毒转基因研究提供基础,本研究从葡萄休眠枝条中扩增获得12个GVA分离物的CP基因序列,全长597nt,编码198个氨基酸。所得分离物间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%~99.8%和92.4%~99.5%,与GenBank中12个GVA CP序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为71.0%~93.1%和81.8%~98.0%。系统进化分析表明,本研究12个分离物CP序列与已报道的GVA Ⅰ组亲缘关系最近。种群变异分析表明,GVA种群具有多种变异体类型,并且多个样品存在不同变异体类型的复合侵染。但绝大多数变异体克隆聚集在GVA Ⅰ组分支,有60%的克隆序列间同源性较高,并且聚集在同一个次级分支Ⅰ Aa,表明其为该GVA种群的优势序列。克隆的GVA CP基因以及优势序列群体的分析为葡萄抗病毒转基因研究奠定了基础。     

响应面分析法优化玉米胚芽蛋白的提取工艺研究

研究了在稀碱条件下玉米胚蛋白的提取工艺,通过单因素实验,选取实验因素与水平,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理,采用3因素3水平的响应面分析(RSA)法,建立了预测蛋白质提取率的数学模型,优化了蛋白质的提取工艺。结果表明,玉米胚蛋白的最佳提取条件为:水料比为11mL/g,pH值为8.7,温度为46℃,在最优条件下提取90min,蛋白质提取率可达58.46%。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段6编码一种非结构蛋白

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是引起我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病的病原.引起玉米粗缩病的RBSDV湖北分离物10条基因组dsRNA全序列已被确定,其中基因组片段6(S6)全长序列为2 645 bp,只含有一个阅码框(82～2 460 nt),编码一个分子量约为89.6 kDa的蛋白(P6).为进一步研究该蛋白的生物学功能,在大肠杆菌中表达了RBSDV基因组片段6编码的P6蛋白并制备了相应的抗血清.Western blotting分析显示,P6抗血清不与纯化的RBSDV粒子蛋白发生反应,而在被RBSDV感染的玉米叶片和带毒的传播介体--灰飞虱中可检测到P6.此结果表明,RBSDV-S6编码的蛋白是一种非结构蛋白.