禾谷镰刀菌甾醇14α脱甲基酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆获得禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)2个甾醇14α脱甲基酶CYP51蛋白(CYP51A、CYP51B)基因c DNA序列,明确其氨基酸序列典型特征,为研究蛋白质结构及其抗药性机制奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆2个CYP51蛋白基因c DNA序列,利用相关生物信息软件对其序列进行生物信息学分析。结果克隆到2条c DNA序列,长度分别为1 524、1 581 bp,分别编码507、526个氨基酸;2个蛋白分子量分别为57.5、59.3 ku,等电点分别为6.93、7.08,不稳定系数分别为49.43、39.05;2个蛋白均含有细胞色素P450家族成员典型的保守结构域;不具有信号肽的属于非分泌性蛋白,具有跨膜结构域,是亲水性蛋白;蛋白质二级结构最主要的结构元件是α螺旋、无规则卷曲,并散布于整个蛋白中;亚细胞定位预测显示,CYP51A蛋白主要位于内质网及高尔基体等细胞器中,而CYP51B主要位于细胞质中。研究结果将为进一步研究CYP51蛋白生物学功能及其蛋白结构生物学提供参考。     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

茶树CsCYP79A1基因克隆及表达分析

【目的】克隆茶树细胞色素P450（CYP）酶系的CYP79酶基因CsCYP79A1,并进行表达分析,为探究CsCYP79A1基因参与茶树防御的响应机制及在乌龙茶制作过程中的调控功能提供理论依据。【方法】克隆CsCYP79A1基因,通过生物信息学软件对其进行分析,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在不同茶树品种、不同嫩度叶片以及不同摇青次数叶片中的表达特性,并采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测定不同处理叶片中的苯乙腈释放量,以分析其与CsCYP79A1基因表达量的相关性。【结果】克隆获得的茶树CsCYP79A1基因编码区（CDS）序列长度为1617 bp,编码538个氨基酸残基,相对分子量为61.07 kD,理论等电点（pI）7.64,为不稳定的脂溶性亲水蛋白。CsCYP79A1蛋白与中华猕猴桃TXG46886.1的氨基酸序列相似性最高,达87%。CsCYP79A1蛋白存在2个跨膜结构,无信号肽,共有40个磷酸化位点,二级结构中α-螺旋、β转角、延伸链和无规则卷曲分别占氨基酸序列的49.07%、4.28%、11.71%和34.94%,三级结构与铁锈醇合酶的晶体结构（5ylw.1.A）相似度为26.61%。在4次摇青处理后,金萱和黄观音第3叶片中的CsCYP79A1基因表达量高于浙农113、白叶1号和福鼎大白茶,说明CsCYP79A1基因在适制乌龙茶的茶树品种中的表达量较高;CsCYP79A1基因在第3叶中的表达量显著高于第1叶和顶芽（P<0.05）,且随着摇青次数的增加呈先升高后降低的变化趋势。4次摇青处理后,第3叶会释放大量苯乙腈,而第1叶和顶芽释放少量或不释放苯乙腈。苯乙腈的释放量随摇青处理次数的增加呈逐渐升高趋势。【结论】CsCYP79A1基因表达量与茶树品种、叶片嫩度和摇青次数密切相关,且其表达量和苯乙腈释放量均为第3叶最高,故推测CsCYP79A1基因是苯乙腈合成途径中的关键调控基因。     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

芜菁花粉发育相关基因BcMF2r的分子克隆及其生物信息学分析

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从'温州盘菜'芜菁(Brassica campestris L. spp. rapifera cv. Wenzhoupancai)中克隆到了BcMF2的同源基因,命名为BcMF2r.经与白菜BcMF2基因序列比较,DNA全长序列相似性高达90%.Blast搜索结果表明,BcMF2r与拟南芥外切多聚半乳糖醛酸酶在氨基酸水平的的相似性为87%,推测BcMF2r属于多聚半乳糖醛酸酶基因.BcMF2r基因最大开放阅读框为1263 bp,编码420个氨基酸序列,编码的蛋白质分子量为43.8 kDa,等电点为8.108;碱性氨基酸(K, R) 36个;酸性氨基酸(D, E) 32个;疏水氨基酸(A, I, L, F, W, V)152个;极性氨基酸(N, C, Q, S, T, Y)113个.推导的氨基酸序列通过Prosite数据库查询,发现该序列包括3个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,6个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个N-豆蔻酰化位点, 1个多聚半乳糖醛酸酶活性位点(257RVTCGPGHGLSVGS)等.通过PROFsec预测BcMF2r蛋白质的二级结构,表明该蛋白含7.86% helix,46.90% sheet和45.24% loop.将BcMF2r基因氨基酸序列与数据库中的其他植物PG序列进行同源序列比对,构建系统进化树,发现该基因具有所有PG基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类,进一步证明了该基因可能是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因,在花粉萌发和花粉管伸长中起作用.     

薹菜CYP79B5基因的克隆及原核表达

以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸.以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段.经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%.经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构.扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在相对分子质量64 000处有一特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致.     

木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

[目的]克隆木薯葡聚糖水合双激酶(MeGWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯MeGWD3基因调控及功能研究提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆MeGWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的pCAMBIA2300载体,构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结果]MeGWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸.经序列比对,发现MeGWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM 002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结论]成功构建的植物表达载体pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究.     

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 k D,理论等电点为8.99,不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 k D,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1﹕409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性。【结论】利用3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用。     

小佛肚竹生氰糖苷合成关键酶CYP79家族同源基因的克隆和鉴定

生氰糖苷是由氰醇衍生物的羟基和D-葡萄糖缩合形成的糖苷,已在2 000多种植物中发现,分属于蕨类植物、裸子植物和被子植物的130个家族.生氰糖苷的主要生物学功能在于阻止食草动物和病原体对植物的侵害.通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术从小佛肚竹Bambusa ventricosa幼笋中克隆到CYP79家族同源基因的cDNA全长,命名为BvCYP79.BvCYP79共有1 913个碱基对,翻译起始点为193碱基处,终止子位于1 752 bp,包含1个1 559 bp的完整编码区,开放阅读框共编码519个氨基酸.具有PERF和SFSTGRRGCIA保守结构域,属于典型的单子叶植物CYP79家族基因.生氰糖苷途径可能也存在于竹类植物,因而在食用笋的安全性评估上具有一定指导意义.     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园;宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存;植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司;氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司;外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂;RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司;其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

蚯蚓细胞色素P450基因的克隆及序列分析

蚯蚓是一种土壤环境的指示生物,参与土壤中有毒化学物质的降解等过程。细胞色素P450酶是动物体内参与外源化合物代谢的主要酶系。本实验通过已有的其他物种的细胞色素P450酶保守序列设计简并引物,用RT-PCR的方法成功扩增出了赤子爱胜蚓体内的一条P450序列(670bp左右,Genbank登录号:KF823788),并对其保守区域、氨基酸构成及三级结构进行了分析。这是首次从蚯蚓体内扩增出P450基因,为下一步从基因层次研究蚯蚓机体对外源化合物的解毒功能及其机理提供了参考。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450 CYP305B1V1基因的诱导表达特征研究

[目的]研究不同诱导物对野桑蚕各组织中细胞色素P450CYP30581V1基因表达的影响。[方法]参照GenBank中公布的野桑蚕CYP305B1V1基因的mRNA序列,设计1对引物,采用半定量RT-PCR方法分析经NaF、芸香苷、氯氰菊酯和蜕皮激素处理的野桑蚕各组织中CYP305B1V1基因的表达情况,并对该基因的氨基酸序列进行同源性比较和进化分析。[结果]氯氰菊酯、芸香苷和NaF影响野桑蚕6TP305B1V1基因在组织中的表达,蜕皮激素无明显影响。氨基酸的同源性分析表明该基因氨基酸序列与家蚕CYP305B1的氨基酸序列同源性最高（100％）;与赤拟谷盗推测的CYP305A1、蜜蜂推测的CYP305A1、果蝇CYP305A1、冈比亚按蚊CYP305A2及库蚊CYP2L1有较高的同源性。[结论]野桑蚕CYP30581V1基因可能主要参与外源性化舍物的代谢,对揭示细胞色素P450的功能和不同药物的代谢机理具有重要意义。     

Identification,Characterization, and Expression of P450 Gene Encoding CYP6BQ13v2 from the Red Flour Beetle,Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae）

An allele of CYP6BQI3, named CYP6BQ 13v2 （GenBank accession no. FJ209361）, was isolated from the red flour beetle, Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae） by RT-PCR. The cDNA sequence of CYP6BQ13v2, 1 563 bp in length, contains an open reading frame of 1 554 nucleotides encoding a putative protein of 518 amino acid residues with a predicted molecular weight of 59.92 kDa and a theoretical pl of 7.60. The putative protein contains the classic hemebinding sequence motif F××G×××C×G （residues 456-465） conserved among all P450 enzymes as well as other characteristic motifs of all cytochrome P450s. It shares 98% identity with the previously published sequence of CYP6BQ13 （GenBank accession no. XP967146） from the T. castaneum genome project. Phylogenetic analysis of amino acid sequences from members of various P450 families indicated that there was closer phylogenetic relationship of CYP6BQ 13v2 with CYP302A1 and CYP307A1 mediating synthesis of the insect molting hormone, distant relationship with CYP6B1 metabolizing plant allelochemicals, CYP6D 1 linking to pyrethroid resistance and other members of CYP6 family. Expression test of the gene in the adults and immature stages of T. castaneum by quantitative real-time PCR revealed that CYP6BQ13v2 is expressed in all life stages investigated. The mRNA expression level in 1st instar larvae was 14.9- and 3.86-fold higher than those in pupae and adults, respectively. The CYP6BQ13v2 expression levels appeared in the order of 1st instar larvae, followed by 4th instar larvae, 7th instar larvae, adult, and pupae from high to low. The more bioinformation of CYP6BQ 13v2 was also analyzed.     

石榴花类黄酮3′羟化酶基因的克隆及序列分析

为研究花色苷生物合成途径中类黄酮3′羟化酶基因(F3′H)的序列信息,以泰山红石榴花瓣为试材,提取总RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中登录的相关物种F3′H基因的保守序列设计兼并引物,对反转录后的cDNA进行PCR扩增并测序。结果表明:在石榴中克隆到了长度为996bp的F3′H基因cDNA片段,该基因编码331个氨基酸,含有细胞色素P450保守域,属于CYP75B亚家族。该序列在GenBank中的登录号为KC430328。     

桔小实蝇P450基因CYP6A41的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)P450基因,研究其在不同组织及发育时期的表达情况,探索其可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆桔小实蝇P450基因CYP6A41;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究CYP6A41mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。采用Homology程序模拟构建CYP6A41蛋白的三维结构,应用CDOCK程序将之与甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲基丁香酚3种气味分子进行模拟对接分析。【结果】克隆获得了桔小实蝇P450基因,并命名为CYP6A41。CYP6A41阅读框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,该蛋白序列与桔小实蝇的另外一种P450蛋白CYP4D46序列的一致性最高,达99.2%。荧光定量PCR分析表明,CYP6A41在桔小实蝇不同发育时期都有表达,并且在化蛹第1天表达量达到最高峰;CYP6A41在各组织中也都有表达,但以触角中的表达量最高;雄虫生殖节中的表达量约是雌虫的6.8倍;对接结果表明,CYP6A41蛋白与3种小分子化合物均能形成稳定的复合物。【结论】CYP6A41在桔小实蝇雌雄生殖节中的差异表达,暗示该蛋白在雄虫生殖生理过程中发挥作用;CYP6A41在化蛹第1天及触角中的高表达量暗示CYP6A41不仅参与了蛹早期的发育过程,且可能参与了嗅觉气味分子的降解过程。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。