陆地棉bHLH转录因子GhMYC4基因的克隆及功能分析

通过电子克隆技术从陆地棉中分离了一个Gh MYC4基因(Gen Bank登录号:KF751654),该基因编码的蛋白属于b HLH类转录因子。生物信息学分析结果显示:该基因完整开放阅读框有1 650 bp,编码549个氨基酸。Gh MYC4蛋白的N-端具有MYC蛋白家族特有的b HLH-MYC-N保守结构域,C端具有高度保守的DNA结合域即b HLH结构域。同源比对和系统进化树分析结果显示Gh MYC4蛋白与陆地棉b HLH转录因子和可可b HLH转录因子的亲缘关系最近,与其他物种的MYC2家族成员具有很大的相似性。通过Real time-PCR检测该基因的组织表达特异性,结果显示该基因在陆地棉的根部和叶片中高效表达,纤维中微量表达。在拟南芥原生质体中进行该基因的瞬时表达,证实了Gh MYC4蛋白定位于细胞核。转Gh MYC4的拟南芥受到高盐和干旱胁迫后相比于对照在表型上表现出很好的抗旱耐盐性能,其叶片相对含水量、可溶性糖含量及脯氨酸含量显著高于对照,MDA含量显著低于对照。该结果为培育抗旱耐盐棉花新品种提供了新的基因来源。     

甜樱桃PaMADS4基因克隆及其表达分析

为研究甜樱桃在高温下胚囊发育的分子机理,以甜樱桃品种‘拉宾斯’为试材,采用RT-PCR结合RACE方法克隆胚囊发育相关的MADS-box SEP类基因c DNA全长,使用半定量PCR法进行特异性表达分析,通过温室和露地环境PaMADS4实时荧光定量分析不同温度下的表达。克隆得到一个基因全长999 bp,命名为PaMADS4(Gen Bank登录号:JQ686726),包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸;序列比对和进化分析表明,PaMADS4与拟南芥SEP基因家族亲缘关系最近;组织特异性分析表明PaMADS4在四轮花器官中均表达;开花后PaMADS4在露地中的表达量明显大于温室。     

陆地棉转录因子Gh WRKY70的克隆及表达分析

【目的】棉花是一种重要的经济作物,雄性不育材料的创造和不育相关基因的挖掘一直是棉花育种工作的热点,Gh WRKY70基因的克隆和表达分析为该基因功能的研究奠定了基础。【方法】根据转录组测序结果,利用Primer 5设计GhWRKY70转录因子全长引物,q-PCR验证Gh WRKY70基因在不育和可育花药中的表达差异。【结果】克隆到Gh WRKY70基因全长为918 bp,定名为Gh WRKY70,Gene Bank号为MF278614。该基因编码的蛋白包含1个典型的WRKY结构域,每个WRKY结构域的C端含有1个C2HC类型的锌指蛋白结构。【结论】同源性分析表明,Gh WRKY70属于III类WRKY蛋白,与亚洲棉和可可的WRKY70的亲缘关系最近。转录因子GhWRKY70在洞A不育花药和可育花药中差异表达,表明该基因可能与雄性不育相关。     

沙田柚F-box蛋白基因的克隆及序列分析

采用生物信息学方法,对沙田柚[Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Shatian Yu.]F-box蛋白基因编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明,该基因全长为1 427 bp(Gen Bank登录号为KR363148),开放阅读框(ORF)全长为1 101 bp,共编码366个氨基酸,编码蛋白质的分子质量43.09 ku,理论等电点5.15。沙田柚F-box蛋白基因编码蛋白含有一个植物F-box蛋白家族的保守结构域,为亲水性非分泌不稳定蛋白,不跨膜运动,共有30个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与甜橙(Citrus sinensis,KDO71185)和克莱门柚(Citrus clementina,XP_006425495)F-box蛋白的同源性分别为99%、98%。系统进化树表明,沙田柚F-box蛋白基因与与甜橙(Citrus sinensis,KDO71185)和克莱门柚(Citrus clementina,XP_006425495)亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

小麦SnRK2.2基因克隆、表达载体构建及转化

SnRK2基因家族成员参与蛋白质的磷酸化,在植物抵御非生物胁迫方面发挥重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列为基础,通过RT-PCR技术克隆得到一个新的小麦SnRK2基因,命名为Ta SnRK2.2,并提交到Gen Bank(登录号:KJ850253)。Ta SnRK2.2基因全长4 118 bp,由9个外显子和8个内含子组成,包含一个1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守,Ta SnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。Ta SnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 k D,理论等电点为5.45,含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域和多处磷酸化位点。构建了Ta SnRK2.2基因过表达载体,转化拟南芥,获得转基因植株,通过RT-PCR方法检测到Ta SnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达。     

沙田柚PIF5基因的鉴定及序列分析

对沙田柚的PIF5转录因子基因进行鉴定和序列分析。生物信息学分析结果表明,该基因全长2 323 bp(Gen Bank登录号:MH020222),含有1 512 bp的开放阅读框(ORF),共编码503个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为54.95 kDa,等电点PI为5.12。该蛋白质含有一个PP2Cc保守结构域,为亲水性稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,该氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)和甜橙(Citrus sinensis)相似性很高,相似度分别达到100%和99%。系统进化分析发现沙田柚的PIF5转录因子基因与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近,属于同一分支。转录组测序结果表明:PIF5基因在沙田柚在未授粉花柱中的表达量(RPKM)为2.94,自花授粉1、2、3 d花柱中的表达量(RPKM)分别为4.35、3.74、3.99,在异花授粉1、2、3 d花柱中基因的表达量(RPKM)则分别为3.39、1.70和0.98。     

纤维素酶系基因的克隆与序列分析

根据Gen Bank已报道的枯草芽孢杆菌的基因序列,设计特异性引物,经PCR分别从B.subtilis L、B.subtilis K基因组中扩增得到3个纤维素酶基因序列,基因片段分别长约700、1 500、1 700 bp。连接到T载体上进行测序,获得该3个纤维素酶基因片段的DNA序列,在线比对分析表明3个基因的部分碱基序列与已报道的纤维素酶基因的序列同源性达99%。这3个基因的全序列在Gen Bank中未见报道,且通过软件对比,三者没有任何相似性。根据3个纤维素酶基因的来源分别命名为Lcen、Ken、Kkg。借助软件分析确定Lcen基因全长699 bp,基因序列为1个完整的阅读框,连续编码232个氨基酸。Ken基因全长1 500 bp,连续编码499个氨基酸。Kkg基因全长1 686 bp,基因序列为1个完整的阅读框,连续编码561个氨基酸。3个基因均属于纤维素酶家族大类。     

黄瓜质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。     

沙田柚乙烯应答因子的鉴定和生物信息学分析

利用高通量测序对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,通过差异分析得到了沙田柚乙烯应答因子基因序列。采用生物信息学方法,对其编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析。该基因全长为1013 bp(Gen Bank登录号为MG905213),开放阅读框(ORF)全长498 bp,编码的蛋白质含166个氨基酸。编码蛋白质的相对分子量为18.45 k Da,理论等电点为7.90。该蛋白质具有一个与AP2 superfamily蛋白相同的保守结构域,为亲水性非分泌不稳定蛋白,不属于跨膜运动,共有24个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白质与芸香科的甜橙(Citrus sinensis,XP-006467696.1)和克莱门柚(Citrus clementina,XP-006449381.1)的AP2蛋白的同源性分别为100%和98%。系统进化树表明,沙田柚的乙烯应答转录因子与甜橙和克莱门柚亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

Molecular Cloning, and Characterization of an Adenylyl Cyclase-Associated Protein from Gossypium arboreum L.

The aim of this study was to clone CAP （adenylyl cyclase-associated protein） gene from Gossypium arboreum L. and develop a platform for expressing and purifying CAP protein, which is a base for the construction and function researches of CAP. In this work, a CAP homolog from cotton （DPL971） ovule was identified and cloned. And the cDNA sequence consisted of an open reading frame of 1 416 nucleotides encoding a protein of 471 amino acid residues with a calculated molecular weight of 50.6 kDa. To gain insight on the CAP role in cotton fiber development, the cloned CAP cDNA was expressed. A significant higher yield pure protein was obtained with the chromatographic method. Further experiments showed that the purified protein can bind with the actin in vitro indicating that the recombinant cotton CAP is functional. The procedure described here produced high yield pure protein through one chromatographic step, suitable for further structure-function studies.     

Cloning and Expressing of a Gene Encoding Cytosolic Copper/Zinc Superoxide Dismutase in the Upland Cotton

In this study, a gene encoding a superoxide dismutase （SOD） was cloned from senescent leaves of cotton （Gossypium hirsutum）, and its expressing profile was analyzed. The gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends （RACE） method. Northern blotting was used to show the profile of the gene expression, and the enzyme activity was mensurated by NBT deoxidization method in different growth periods. The full length of a gene of cytosolic copper/zinc superoxide dismutase （Cu/Zn-SOD） was isolated from cotton （GenBank Accession Number： DQ445093）. The sequence of cDNA contained 682 bp, the opening reading frame 456 bp, and encoded polypeptide 152 amino acids with the predicted molecular mass of 15.03 kD and theoretical pI of 6.09. The amino acid sequence was similar with the other plants from 82 to 87%. Southern blotting showed that the gene had different number of copies in different cotton species. Northern blotting suggested that the gene had different expression in different tissues and development stages. The enzyme activity was the highest in peak flowering stage. The cotton cytosolic （Cu/Zn-SOD） had lower copies in the upland cotton. The copper/zinc superoxide dismutase mRNA expressing level showed regular changing in the whole development stages; it was lower in the former stages, higher in latter stages and the highest at the peak flowering stage. The curve of the copper/zinc superoxide dismutase mRNA expressing level was consistent with that of the Cu/Zn-SOD enzyme activity. The copper/zinc superoxide dismutase mRNA expressing levels of different organs showed that the gene was higher in the root, leaf, and lower in the flower.     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

发育中棉纤维硫酸木质素含量的动态变化

[目的]比较发育中棉纤维硫酸木质素含量的动态变化.[方法]采用硫酸法测定发育中棉纤维木质素含量.[结果]单位棉铃硫酸木质素含量随棉纤维次生壁的增厚呈递增趋势,海岛棉硫酸木质素含量总体低于陆地棉.棉纤维硫酸木质素含量的动态变化呈“S”型曲线,棉纤维硫酸木质素含量变化符合Logistic函数,陆地棉硫酸木质素含量快速累积时期持续的时间长于海岛棉,但单位棉铃硫酸木质素含量最大累积速率出现的时间要晚于海岛棉,而陆地棉单位棉铃硫酸木质素最大累积速率(Vmax)与海岛棉间没有显著差异.[结论]海岛棉与陆地棉相同发育时期内的硫酸木质素含量差异显著.     

胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析

以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术(PCR)体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因(AFP),将其连接到pGEM-Teasy vector载体上,并对其进行生物学信息分析.结果表明:克隆的AFP基因片段全长1 206bp,其中编码区长1 026bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主.与GenBank中(A91926.1)的基因序列和氨基酸序列比较,同源性分别为99.4%和97.6%,表明AFP基因克隆成功.与不同地方品种胡萝卜AFP基因做同源性比较,结果发现不同品种间的AFP基因保持着很高的内同源性.     

棉花LTPG基因家族的蛋白结构与基因表达分析

大量研究表明脂类化合物参与了棉花纤维的起始与伸长发育,GPI锚定的脂质转运蛋白（LTPG）是脂类细胞器之间运输的候选蛋白,对雷蒙德棉（D组）的LTPG家族的蛋白质结构与基因表达进行了分析。结果发现：LTPG基因家族可以分为8个亚类;不同亚类的蛋白的保守半胱氨酸残基位置/分布等具有显著特征;LTPG基因的启动子具有MYB等多种转录因子结合元件以及多种激素应答元件;LTPG基因家族在纤维发育过程中存在着3种不同的表达模式。上述结果表明LTPG基因家族可能参与棉花纤维起始与伸长发育,其功能值得深入分析。     

外源纤维改良基因对棉花纤维品质的影响研究

将由棉纤维细胞特异表达启动子驱动的外源纤维改良基因(兔角蛋白基因)，通过花粉管通道转基因法，导人陆地棉品种(系)苏棉16号、泗棉167、渝棉1号和H1。检测结果表明，转兔角蛋白基因苏棉16号和泗棉167的纤维比强度分别比相应对照增加了23．2％和29．6％，马克隆值下降了13．3％和17．0％，纤维长度与对照接近。结果还表明，外源基因对高品质棉花品种(系)渝棉1号和H1纤维品质的影响不明显，只是衣分有所增加。